1肝细胞癌患者 D二聚体和 纤维蛋白原多肽的改变作者：范秉琳朱武凌邹国林 【关键词】, 肝细胞癌 关键词 :肝细胞癌;D-二聚体;-纤维蛋白原多肽 摘要 :目的探讨在肝细胞癌（HCC）患者中 D-二聚体和 -纤维蛋白原多肽（FGG）的生化改变及其临床意义.方法采用酶联免疫吸附反应定量检测了 57 例 HCC 患者的血浆 D-二聚体，通过 RT-PCR分析了编码 FGG 的 mRNA 在病变组织的转录水平.结果 HCC 患者的血浆 D-二聚体含量（ 0.810.21）mgL-1 显著高于正常对照组（0.150.07）mgL-1（P0.01）;在各临床分期之间 D-二聚体含量差别非常明显，尤以转移期癌 D-二聚体测定值的升高最为显著.FGG 的 mRNA 在癌组织中的表达较癌旁非癌组织明显上调，同时还发现这种表达增强与淋巴结转移相关.结论D-二聚体的异常增高、 FGGmRNA 的高表达与 HCC 的临床分期和淋巴结状况关系密切. Keywords:hepatocellularcarcinoma;D-dimer;gammafib-rinogenpolypeptide Jinchutou.com2Abstract:AIMToinvestigatethebiochemicalchangesofD-dimerandgammafibrinogenpolypeptide（FGG ） ，andtheirclinicalsignificanceinhepatocellularcarcinoma（HCC）.METHODSPlasmaD-dimerlevelswerequantitatedin57patientswithHCCbyusingELISA，andthetranscriptionallevelofmRNAencodingFGGwasdetectedinlesiontissuesbyRT-PCR.RESULTSTheplasmaD-dimerlevelwassig-nificantlyhigherinHCCgroup（0.810.21）mgL-1thaninnormalcontrolgroup（0.150.07）mgL-1（P0.01）.Therewasasignificantdifferencebetweentheclinicalstages，andespeciallyD-dimervalueofmetastasticstagewaselevat-edmostmarkedly.TheFGGmRNAexpressionwasup-regu-lateddramaticallyincanceroustissuescomparedwithsur-roundingnon-canceroustissues，anditwasalsodiscoveredthatsuchoverexpressionwascorrelatedwithlymph-nodemetastasis.CONCLUSIONTheabnormalelevationofD-dimerandtheoverexpressionofFGGmRNAarecloselyre-latedtoclinicalstageandlymphnodestatusofHCC. Jinchutou.com30 引言 肝细胞癌（HCC ）在我国常见，D-二聚体（D-dimer）是在纤溶酶作用下交联纤维蛋白的特异降解产物，为继发性纤溶的特征性分子标志物，其增高提示机体内纤溶活性亢进.研究发现它在肝脏疾病中呈现不同程度的增高现象1 ，在乳腺癌和卵巢癌患者血浆中 D-dimer 含量的升高与病情进展相关2 .-纤维蛋白原多肽（FGG ）是组成纤维蛋白原的三对不同多肽链之一，具有一个血小板粘附序列，至今尚未见关于 FGG 与 HCC 之间关系的研究报道.我们检测了 57 例 HCC 患者的血浆 D-dimer 含量，以及编码 FGG 的mRNA 在病变组织中的转录水平，探讨二者在 HCC 患者中的生化改变及其临床意义. 1 对象和方法 1.1 对象本院 2000-06/2002-01 入院 HCC 患者 57（男46，女 11）例，年龄 2976（平均 52.5）岁.所有患者经手术、影像或病理学检查确诊.临床分期参考国际抗癌联盟（UICC）的TNM 分期方案制订，期:癌结节与周围组织界限清楚，未侵犯血管;期 :癌细胞已侵入血管;期:肝内形成多处转移或发生淋巴结转移.57 例 HCC 患者中，期 7 例，期 26 例，期 24 例. 正常对照组为 30 例体检健康成人.D-dimer 酶联免疫反应检测试剂盒购自Jinchutou.com4上海捷门生物公司.总 RNA 抽提试剂盒为德国 Qiagen 公司产品，RT-PCR 引物均由上海生工公司合成， AMV 反转录酶和 TaqDNA聚合酶购自 Clontech 公司，DNA 分子量标准物购自 MBI 公司. 1.2 方法 1.2.1 血浆 D-dimer 检测采用酶联免疫吸附反应法，简要过程如下:在包被单抗的酶标反应板上，加入待测样品和不同浓度的标准品，37孵育 1h，洗涤 4 次，甩干后再加入酶标抗体， 37孵育 25min，使血浆样品中的抗原与酶标记的 D-dimer 抗体充分发生反应.显色反应终止后，用酶联仪 490nm 进行比色，读取并记录A 值.制作标准曲线，查得待检样品的 D-dimer 含量（mgL-1）.检测结果采用 t 检验进行统计学处理. 1.2.2 编码 FGG 的 mRNA 表达的 RT-PCR 检测经手术取HCC 患者的新鲜癌组织和癌旁非癌组织，液氮速冻，-80 保存.用Qiagen 试剂盒抽提待检组织的总 RNA，并测定其浓度和完整性 .以1g 总 RNA 为模板，采用 oligo-dT 引物，用 AMV 反转录酶在50作用 30min，合成 cDNA 链，随后以此为模板，加入 FGG 的上下游引物（5TGTTGTGCCAGTAGGAG3 ，5CTTAGATGAAAGATTCGGTAG3）和阳性对照 -actin 的上下游引物（5-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3 ，5-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3） ，以及 TaqDNA 聚合Jinchutou.com5酶，在 94变性、56退火和 68延伸条件下进行反应，电泳检测反应结果.2 结果 2.1 血浆 Ddimer 含量健康成人为（0.150.07）mgL-1.HCC 患者为（0.810.21）mgL-1，显著高于正常对照组（P0.01 ）.， 和期各组 D-dimer 检测值均高于正常对照组，且随病情进展，D-dimer 含量呈递增趋势;特别是临床期（1.130.34）mgL-1，即发生肝内和淋巴结转移组，与期（0.410.08）mgL-1 和期（0.620.12）mgL-1 相比较，D-dimer 的检测值升高最明显（P0.01） . 2.2FGGmRNA 在 HCC 患者病变组织中的表达从 HCC 患者癌组织和癌旁非癌组织的 RT-PCR 电泳结果发现，FGGmRNA 在癌组织中的表达均较癌旁非癌组织明显上调（Fig1）;并且进一步发现，有淋巴结转移的癌中 FGGmRNA 表达的增高程度较小肝癌更加明显（Fig2） ，初步提示 FGGmRNA 的表达上调可能与肿瘤的转移相关. 图 1图 2 略 3 讨论 肝脏既是合成凝血酶原、凝血因子和抗凝血酶的器官，也是Jinchutou.com6纤溶酶原和 2 纤溶酶抑制物的主要产生场所，可见肝脏与机体凝血-抗凝血、纤溶-抗纤溶的关系极为密切和复杂.肝脏的病变势必将对机体正常时所维持的凝血和纤溶两系统间的平衡造成非常不利的影响.D-dimer 是纤维蛋白在局部发生交联集聚，继而被纤溶酶水解后的特异产物，是衡量体内纤溶活性的特异指标，而 FGG 则是纤维蛋白原（凝血因子）的重要组成部分，与纤维蛋白原的合成及功能密不可分.我们发现，各期癌 D-dimer 的测定值均高于正常对照（P0.01） ，并随着临床分期的递进而迅速升高;癌组织中FGGmRNA 的表达较癌旁非癌组织明显增强，并与淋巴结转移的发生相关.分析造成上述结果的原因: 癌细胞可释放出 ADP3 ，后者是引起血小板聚集最重要的物质;同时，当癌侵犯血管后，造成内皮细胞损伤释放组织因子和内皮下的胶原裸露激活因子，启动外源性和内源性凝血过程;大多数 HCC 患者合并肝硬化，肝功能下降，包括合成抗凝血酶、2 纤溶酶抑制物的能力，以及对纤溶酶类激活物的清除等.在上述因素的综合作用下，一方面使机体内局部血栓（如肝门静脉血管内微血栓和癌栓）形成的机会提高，另一方面导致纤溶酶活性相对增强，致使体内纤溶活性亢进，血中 D-dimer 浓度便会异常升高，并随着病情的加重而持续增加.我们已知纤维蛋白原 ， ， 链的表达调控具有协同性，也就是说会呈现一致性的上调或下降.因此，FGGmRNA 在 HCC 中表达增高意味着 ， 的表达也上调，纤维蛋白原的合成增多.纤维蛋白原参与凝血的作用显而易见，无论外源性还是内源性凝血，最终要通过它（凝血因子Jinchutou.com7）来起底物作用;另外，纤维蛋白原还是 ADP 促血小板凝集作用的必须物质.所以它的增多在一定程度上促进了血栓形成，在纤溶酶作用下，导致纤维蛋白降解产物如 D-dimer 的血浆含量升高.这表明 -纤维蛋白原多肽与 D-dimer 之间具有内在相关性 .研究发现，通过血小板整合素 alphavbeta3 的介导，癌细胞可与纤维蛋白原和其血浆降解产物 X，D 片段粘附，促进结肠癌细胞的扩散4.而实际上 D 片段主要是由 FGG 构成，具有血小板粘附序列HHLGGAKQAGDV5 ，可见此序列与肿瘤细胞的粘附有关.本结果显示，HCC 中 FGGmRNA 表达的上调与肿瘤的淋巴结转移之间关系密切，同上述研究相符.再联系 D-dimer 与 FGG 的相关性，提示血浆 D-dimer 的升高是对 HCC 病情演进的一种间接反映 . 参考文献: 1HuKQ，YuAS ，TiyyaguraL，RedekerAG，ReynoldsTB.Hy-perfibrinolyticactivityinhospitalizedcirrhoticpatientsinarefer-ralliverunitJ.AmJGastroenterol，2001;96（5）:1581-1586. 2DirixLY，SalgadoR，WeytjensR ，ColpaertC，BenoyI，HugetP，vanDamP，ProveA，LemmensJ，VermeulenP.PlasmafibrinD-dimerlevelscorrelatewithtumourvolume，progressionrateandsJinchutou.com8urvivalinpatientswithmetastaticbreastcancerJ.BrJCancer，2002;86（3）:389-395. 3OlasB，WachowiczB，MielickiWP.Roleofphosphoinositide3-kinaseinadhesionofplateletstofibrinogenstimulatedbycancerprocoagulantJ.Platelets，2001;12（7）:431-435. 4McCartyOJ，MousaSA，BrayPF ，KonstantopoulosK.Immo-bilizedplateletssupporthumancoloncarcinomacelltethering