1肾实质性高血压 INSR 基因第 8 外显子多态性分析【关键词】 高血压摘要 目的 探讨肾实质性高血压胰岛素受体（INSR ）基因第 8 外显子多态性，试图从遗传角度寻求病因。方法 采用多聚酶链反应（PCR）和限制性内切酶片段长度多态性分析（RFLP）的方法对 38 例肾实质性高血压肾功能正常者(RHNRF)、45 例肾实质性高血压肾衰竭者(RHCRF)及 38 例正常血压者(NC)全血 INSR 基因第8 外显子 Nsi 多态性进行分析检测。结果 未发现中国人肾实质性高血压 INSR 基因第 8 外显子 Nsi多态性改变，两病人组 N2 等位基因频率与正常对照组比较无显著性差异（2=0.06、0.08，P0.05） 。结论 INSR 基因第 8 外显子Nsi多态性与中国人肾实质性高血压无关，N2 等位基因并非其易感基因。关键词 高血压，肾性；肾衰竭，慢性；受体，胰岛素；聚合酶链反应；限制性片段长度多态性 ABSTRACTObjectiveTo investigate the relationship between polymorphism of insulin receptor (INSR) gene Exon 8 and the etiology of renal hypertension. MethodsPolymerase 2chain reaction (PCR) combined with restriction fragment length polymorphism (RFLP) was used to detect and analyze the polymorphism of INSR gene Exon 8 in 38 renal hypertensive patients with normal renal function (RHNRF), 45 patients complicated by chronic renal failure (RHCRF) and 38 normal controls (NC). ResultsNo polymorphism of Nsi in INSR gene Exon 8 was found to be correlated with renal hypertension in Chinese. N2 allele frequency of INSR gene had no difference between renal hypertension with or without chronic renal failure （2=0.06, 0.08;P0.05）. ConclusionNsi polymorphism of INSR gene Exon 8 has no relation with renal hypertension in Chinese. N2 allele of INSR gene is not the correlated gene of renal hypertension. KEY WORDShypertension, renal; kidney failure, chronic; receptors, insulin; polymerase chain reaction; restriction fragment length polymorphism高血压病人中由肾脏病引起者约占 10%，继发性高血压病人中肾脏病引起者占第一位，原发性高血压（EH）中约 20%最终发展至终末期肾病1 。虽然关于高血压肾损害及肾脏疾病引起高血压的研究甚多，但对其确切的发生机制，至今未能完全阐明。本研究拟3通过限制性内切酶片段长度多态性分析的方法，对肾实质性高血压病人的全血胰岛素受体(INSR)基因第 8 外显子多态性进行分析，从分子水平探讨肾实质性高血压的病因。1 资料与方法1.1 对象与分组1.1.1 肾实质性高血压肾功能正常（ RHNRF）组 38 例，男 18例，女 20 例，年龄 2568 岁，平均（45.911.3）岁。收缩压18.67 kPa，舒张压12.00 kPa；肾活检诊断为各种肾实质性疾病引起的高血压，除外肾血管性高血压；尿常规异常，血尿素氮（BUN） 、肌酐（Cr）尚在正常范围。1.1.2 肾实质性高血压肾衰竭（RHCRF ）组 45 例，男 23 例，女 22 例，年龄 2369 岁，平均年龄（46.312.7）岁。、同RHNRF 组，血 BUN20 mmol/L，Cr 445 mol/L。1.1.3 正常对照（NC ）组 38 例，男 20 例，女 18 例，年龄2760 岁，平均（42.98.7）岁。收缩压18.67 kPa，舒张压12.00 kPa，排除肾脏疾病及糖尿病，亦无高血压、肥胖及糖尿病家族史。41.2 方法1.2.1 临床及生化检查 病人均询问病史，测量血压、身高及体质量，计算体质量指数（BMI） ；取空腹静脉血，用自动生化仪测定肾功能及血脂情况。1.2.2 INSR 基因第 8 外显子多态性测定 DNA 提取：取静脉全血 5 mL，用 100 g/L EDTA 抗凝， 采用美国 Promega 公司提供的 DNA 提取试剂 期徐岩，周海燕，马瑞霞肾实质性高血压 INSR基因第 8 外显子多态性分析 59 盒提取 DNA。PCR 反应：引物设计参照文献2方法，由上海生物工程研究所合成。上游引物序列：5CGGTCTTGTAAGGGTAACTG3，下游引物序列：5GAATTCACATTCCCAAGACA3。PCR 反应体系 25 L（DNA模板 150 ng、dNTP 200 mol/L、上下游引物分别为 20 pmol、10Buffer 2.5 L、MgCl2 2.5 L、TaqDNA 聚合酶 1 U） ，PCR 反应条件为：94 预变性 3 min；然后 94 30 s，55 30 s，72 1 min，共 35 个循环；最后 72 延伸 5 min。酶切：取 PCR 产物 20 L用限制性内切酶 Nsi 进行酶切，酶切产物经20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，紫外线显影、摄片。1.2.3 统计学处理 采用 SPSS 10.0 for Windows 统计软件对资5料进行统计分析。计数资料及组间频数的比较采用 2检验；计量资料以s 表示，组间比较采用方差分析。2 结 果2.1 一般临床资料比较病人组除收缩压（SBP） 、舒张压（DBP）显著高于对照组外，胆固醇（TC） 、三酰甘油 (TG)水平与正常组相比，均无统计学差异，具有可比性。见表 1。2.2 INSR 基因表达情况标本经引物 P1、P2 行 PCR 扩增，扩增片段长度为 322 bp（见图 1） 。2.3 纯化后 PCR 产物的酶切鉴定PCR 产物经 Nsi内切酶消化后，紫外线灯下观察出现不同的条带。N1N1 基因型只有长 322 bp 一条带，N1N2 基因型有长322、 238、 84 bp 三条带，N2N2 基因型有长 238、84 bp 两条带。见图 2。2.4 各组等位基因频率6见表 2。由表 2 可知，两病人组 N2 等位基因频率与 NC 组比较，差异无显著意义（2=0.06、0.08，P0.05） 。3 讨 论EH 病人中约 50%存在糖耐量异常或并发非胰岛素依赖型糖尿病，有学者认为高血压为一代谢性疾病，胰岛素抵抗（IR）和继发性高胰岛素血症可能会导致血压升高，参与 EH 发生、发展3 。胰岛素通过 INSR 起作用， INSR 的结构和功能决定了细胞对胰岛素作用的反应，是 IR 的重要原因之一。INSR 是由多亚基组成的跨膜糖蛋白，由两表 1 各组一般临床资料比较（略）图 1 PCR 扩增片段电泳结果 图 2 纯化后 PCR 产物经 Nsi酶切反应结果表 2 INSR 基因型及等位基因频率比较（略）已有研究证实，INSR 基因第 8 外显子多态性与 EH 有关，1991年，HANIS 等4 发现人工合成的 INSR 基因第 8 外显子具有多7态性；1996 年澳大利亚 SCHRALER 等5研究显示，INSR 基因第 8 外显子 Nsi 多态性与高加索人 EH 有关， EH 组 N1 等位基因频率高于正常对照组。而我国林从容等6研究结果则显示，INSR 基因 Nsi 多态性与中国人 EH 有关，但与前者不同的是中国EH 病人 N2 而非 N1 等位基因频率高于正常组。之后进一步的研究显示，N2 等位基因可能是男性 EH 的易感基因7 。PCR 扩增产物为长 322 bp 片段，INSR 基因第 8 外显子含有 Nsi 酶的特异性酶切位点3 。纯化后 PCR 产物经 Nsi内切酶消化后，产生 3 种基因型条带，若 6 244 位核苷酸存在 GA 碱基替换，则产生Nsi切点（ATGCAT ） ，称为 N2 等位基因。经 Nsi内切酶消化后，产生长 238 bp 和 84 bp 两个片段。反之，若 6 244 位核苷酸无 GA 碱基替换，则不产生 Nsi 切点，称之为 N1 等位基因，经 Nsi内切酶消化后，只有长 322 bp 一个片段。本文作者曾研究显示，INSR 基因第 8 外显子 Nsi多态性与中国人 EH，特别是与EH 肾损害肾衰竭显著相关，N2 等位基因可能是中国人 EH，特别是 EH 损害并发肾衰竭的一个重要易感基因8 。高血压是慢性肾衰竭尿毒症期最常见的并发症，关于肾脏病引起高血压的研究甚多，但对其确切的发生机制，至今未能完全阐明。肾素活性增高在肾血管性高血压早期及部分肾实质性高血压发生中起着重要的作用。近年来对肾脏排钠功能障碍致钠、水潴留造成容量扩张引起高血压给予了更多的关注，但在各种不同的肾实质疾病，高血压的发生机制不完全相同。IR、高胰岛素血症、糖耐量异常可能是尿毒症高血压8的重要发病机制。尿毒症 IR 的发生机制目前尚未阐明，有人认为与尿毒症毒素积聚和代谢性酸中毒有关。本实验结果显示，肾实质性高血压，无论其是否伴发尿毒症，均未发现有 INSR 基因 Nsi 的多态性改变。因此，至少目前尚不能用 INSR 基因多态性来解释肾性高血压并发 IR 的发生机制。同时，也证实了高血压并发尿毒症与尿毒症并发高血压确实存在不同的遗传基础。参考文献1BROWN M H, WHITWORTH J A. Hypertension in human renal dieasesJ. J Hypertens, 1991,10:701.2SEINO S, SEINO M, BELL G I. Human insulin receptor gene: partial sequence and amplification of exons by polymerase chain reactionJ. J Diabetes,1990,39:123.3MORRIS A D, PETRIE J R, CONNELL J M, et al. Insulin and hypertensionJ. J of Hypertens， 1994,12:633.4HANIS C L, BERTIN T K. Identification of an insulin receptor exon 8 Nsi polymorphism using the polymerase chain reactionJ. J Nucleic Acid Research，1991,18:5923.5SCHRADER A D, ZEE R Y L, MORRIS B