开题报告课题名称：E钙黏蛋白在胃癌侵袭转移的影响课题负责人： 负责人所在单位：*医学院填表日期：20*年7月1.选题的来源、目的、意义和基本内容1.1 选题来源胃癌( gastric cancer)是一个全球性的疾病，在癌症相关死亡中列第2位1，近年来全球新增患者约870, 000 例，死亡人数超过630, 000 例2 。胃癌严重危害着我国国民的健康，高居消化道恶性肿瘤发病率、死亡率之首，而且是我国癌症患者死亡的主要疾病之一。经过医学界几代人数十年的不懈努力，尤其是近10年来影像学诊断及综合治疗手段不断提高，胃癌的疗效已获得了明显的进步，但不可否认，其总体治愈率仍难以令人满意，死亡率居高不下，大多数患者仍死于胃癌的局部复发或远处转移3,4。究其原因，一方面是与我国国民经济水平不高、大众保健意识薄弱等原因导致的早期胃癌检出率低有关，另一方面也表明现有的进展期胃癌的治疗方式包括扩大切除范围及淋巴结清扫范围、术后化疗均无法使5年以上生存率显著提高，对于病期较晚的进展期胃癌，肿瘤给机体带来的往往已不再是一个局部问题,学术界对此初步达成了两个共识： 单纯外科手术无法达到生物学意义上的根治，即便扩大切除和淋巴结清扫范围，仍然如此； 未出现远处转移的胃癌患者，姑息切除的效果较之未手术者好。能否根治性切除是胃癌患者最重要的预后因素之一，直接影响预后5，6。但是手术对于进展期胃癌的治疗效果并不理想，术后5年生存率往往较低，特别是对于B 和期的晚期胃癌患者，往往只能进行姑息性手术， 术后局部复发及转移的发生率仍可高达60% 以上7，是治疗失败的主要原因。大量事实证明，恶性肿瘤病变初期的治愈率是相当高的8。所以治愈肿瘤的关键是早期诊疗技术的成熟和实施。分子生物学理论和技术在胃癌研究工作中的应用，使得人们从基因分子水平对胃癌的发生、诊断、治疗有了新的思路。因此，从分子水平上探究胃癌侵袭、转移的机制，提高早期胃癌的检测水平，具有重要的学术价值和临床意义。最近的研究表明，肿瘤的转移是一个涉及多基因、多分子水平改变的复杂过程,包括瘤细胞的脱落、迁移、粘附、生长等不同步骤。从原发部位脱落和向它处迁移,需要瘤细胞间粘附力降低9,10。细胞粘附分子家族是介导细胞粘附作用的一大类分子,尤以上皮钙粘蛋白(epithelial-cadherin,E-cad)在肿瘤转移中的作用令人瞩目。上皮型钙粘蛋白(E-cad)广泛分布于上皮组织，是基因CDH1编码的一类介导细胞-细胞间相互粘附、具有维持组织结构完整性和极性的钙离子依赖性跨膜糖蛋白，主要介导同种细胞间粘附反应。相对分子量为120 KD，基因定位于染色体16q22.1。E-cad的前体是135 KD的多肽，合成后很快在高尔基体上加入碳水化合物成为成熟的多肽并被释放到细胞表面并迅速定位于细胞接触，从而介导相邻细胞间的同种连接。在细胞外钙离子参与下介导同种亲和性细胞间的粘附和细胞与细胞外基质的粘附，保证上皮细胞紧密有序聚集，抑制移动。当其表达下调或功能障碍时，将使同种细胞失去粘附，对于上皮源性肿瘤而言，则意味着肿瘤细胞具备侵袭性生长的特点，并容易从原发病灶脱落分离，向局部淋巴结转移或远处转移11,12。DNA甲基化是指DNA双螺旋中胞嘧啶核苷的嘧啶环5位碳原子发生甲基化，并与其3端的鸟嘌呤形成CpG，且在双链对称出现，60%的表达基因的启动子内含有CpG重复序列，这种富含CpG序列的DNA片段即被称为CpG岛。近来研究出甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法,其原理是用亚硫酸氢盐对DNA进行处理后，DNA中的C转变为U，而如果被检测基因已经发生CpG岛甲基化，则不能发生这种转化，设计不同的引物做PCR,即可检测出这种差别，从而确定目的基因有无CpG岛甲基化，此方法DNA需要量极少，敏感性高，为基因CpG岛甲基化研究提供了有效的方法。目前认为：基因表达与CpG岛甲基化程度呈负相关13,14。DNA甲基化异常分为甲基化增强和甲基化减弱两种类型，可引起与细胞增殖和分化等有关的基因表达异常，导致细胞恶变，最后形成肿瘤。DNA异常甲基化导致肿瘤发生的可能机制如下15，16：首先，在正常情况下非甲基化的CpG岛的高甲基化，可以导致肿瘤抑制基因的失活。其次，DNA甲基化可以促进肿瘤相关基因的突变，是肿瘤相关基因甲基化促进细胞恶变的一种机制。另外，癌基因的低甲基化也可能与肿瘤发生有关17。DNA异常甲基化在肿瘤发生中起着极为重要的作用，它主要表现为抑癌基因高甲基化所致的基因失活和原癌基因低甲基化所致的基因激活，引起与细胞增殖、分化相关基因的表达异常，造成细胞恶性变形成肿瘤18，19。由于DNA局部甲基化增强在肿瘤中最常见，与肿瘤的关系比较明确，被认为是肿瘤抑制基因失活的重要途径，研究取得的进展也报道的最多。1.2研究目的：（1）从DNA、RNA和蛋白水平综合分析胃癌中E- cadherin基因表达（2）阐明E- cadherin在胃癌浸润转移中的作用机制（3）分析胃癌患者临床病理资料，探讨E- cadherin对胃癌预后的影响。1.3研究意义：目前为止，E-钙粘蛋白在多种癌组织中表达不稳定或低表达，并且与肿瘤细胞低分化相关已得到证实。但在肿瘤侵袭和转移过程中的作用及其分子调控机制也尚不清楚。联合检测DNA水平、mRNA水平及蛋白水平的表达，探讨E- cadherin与胃癌侵袭转移的相互关系，国内外报道较少。本课题通过研究癌旁正常组织和胃癌中E- cadherin的DNA、RNA和蛋白水平的表达，来探讨E- cadherin在胃癌侵袭、转移构成中的作用机制和调控机制，同时针对临床病理特征的相关性及它们间的相互关系的研究，来探讨E- cadherin在胃癌的浸润和转移中的作用。以期为胃癌的早期诊断和早期治疗提供理论依据，从而指导临床工作。1.4基本内容：（1）分别应用免疫组化SP法检测60例胃癌组织和癌旁组织中的E-cad蛋白表达。（2）应用MSP法检测60例胃癌组织和癌旁组织中E-cadDNA甲基化水平（3）原位杂交检测60例胃癌组织和癌旁组织中的E-cad mRNA表达（4）分析临床病理资料，探讨E- cadherin在胃癌侵袭转移中的作用及对预后的影响。2 研究方案：2.1 研究材料 选取*医学院第一附属医院收集胃癌手术新鲜标本*例（每例标本取材均包括癌组织和癌旁组织，癌旁组织选取距癌6-8cm、肉眼观相对正常处，术前均未行放、化疗，离体时间不超过30分钟），所有癌旁组织标本均未发现肿瘤浸润。2.2主要试剂鼠抗人E-钙粘蛋白单克隆抗体、SP试剂盒，组织基因组DNA提取试剂盒，TaqDNA聚合酶、DNAMarker。亚硫酸氢钠（sodiumbisulfite）、氢醌（hydroguinone）。2.3 研究方法（1）甲基化检测:进行DNA修饰及纯化。甲基化特异性引物（M）上游引物：5GGT GAA TTT TTA GTT AAT TAG CGG TAC 3；下游引物：5CAT AAC TAA CCG AAA ACG CCG 3。非甲基化特异性引物（U）上游引物：5GGT AGG TGA ATT TTT AGT TAA TTA GTG GTA 3，下游引物：5ACC CAT AAC TAA CCA AAA ACA CCA 3。甲基化特异PCR反应:反应体系25l，反应条件:95预变性5 min，94变性30s,54退火30s,72延伸70分钟，终末延伸72延伸7min。取10lPCR产物，加2l上样缓冲液，混匀加入上样孔中，将同标本的甲基化与非甲基化PCR产物放同一组进行电泳。电泳条件：80V，室温下电泳30分钟，观察结果并摄影。（2）原位杂交检测：石蜡切片经常规脱蜡，固定后加杂交液恒温箱3842过夜，洗涤后，滴加鼠抗地高辛及SABC-AP后染色， 37显色20分钟，充分水洗，核固红复染。（3）免疫组化染色：常规3m连纹切片、脱蜡，并严格按试刑盒推荐的程序进行DAB显色，苏木素复染、脱水、透明并封片。用PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。（4）结果判定：E-cadherin甲基化特异性引物扩增出相应长度(204bp)的片段，判断甲基化阳性；E- cadherin非甲基化特异性引物相应长度(21lbp)的片段，判断甲基化阴性。E-cadmRNA均采用不加探针标本作阴性对照，采用博士德公司赠送的阳性切片做阳性对照。E-cadmRNA的细胞浆着色呈蓝色。E-cad蛋白采用PBS代替一抗作为阴性对照，采用已知的阳性标本作为阳性对照。染色强度计分与阳性细胞百分比乘积3者为阳性染色结果，由两名病理科医师采用双盲原则评定。（5）随访：采用信函和电话调查的方式进行术后随访，随访时间5年，随访调查问卷内容包含有术后复查情况、有无术后放化疗，有无复发转移，有无新发疾病及合并症等，所有患者每3个月查肿瘤标记物，每6个月行CT检查，每年1次内镜检查。3 研究时间安排2007.7-2008.4 准备阶段：查阅文献资料，了解研究动态，确定研究内容，完成开题报告，采集胃癌组织及癌旁组织病理标本。2008.4-2009.4 制定研究方案，确定研究方法，开展研究工作。2009.4-2013.7 完善研究工作，汇总资料、整理数据，分析取得研究结果。2013.7-2014.5 撰写研究报告、论文；准备成果鉴定、上报等。4 参考文献1 Parkin DM, Bray F, Ferlay J , et a1. Global cancer statistics, 2002 J .CancerJ Clin, 2005, 55: 74-108.2 Macdonald JS. Role of post-operative chemoradiation in resected gastric cancer J. J Surg Oncol, 2005, 90: 166-170.3 杨少辉,戴冬秋.肿瘤抑制基因甲基化与胃癌J.中国普外基础与临床杂志，2006， 13(5)： 614-616.4 詹文华 胃癌多学科综合治疗模式J 中国实用外科杂志，2009，29（9）：722-726.5 黄炽明 万进 杜嘉林 进展期胃癌的外科治疗J广东医药，2005，26（9）：1222- 1223.6 李琛，朱正纲，燕敏 期胃癌外科手术治疗的临床价值，J上海交通大学学 报（医学版）2007，27（5）：569-572.7 邢会军 胃癌的现代外科治疗J中国综合临床，2005，21（3）：287-288.8 詹友庆 李威 孙晓卫等 胃癌外科治疗的远期疗效研究J中华外科杂志，2005，49（17）：1109-1113.9 ITO T, KAWAMURA J, SOMA T, et al. Prognostic analysisof E-cadherin gene promoter hypermethylation in patients with surgically resected ,node-positive , diffuse gastric cancer J Clinical Cancer Research , 2004 , 10 : 2784 - 2789.10 SHIMADA Y, YAMASAKI S , HASHIMOTO Y, et al. Clinical significance