1莪术油对白血病细胞株的体外抑制作用【关键词】莪术油 摘要：【目的】通过比较莪术油对白血病细胞株HL-60 和 K562 抑制作用的敏感性，评估该药物用于治疗白血病的临床意义及价值。 【方法】取 HL-60、K562 细胞传代接种于 96 孔板，同时每孔分别加入不同浓度的莪术油液 100?L(终浓度分别为400、 200、 100、50?mg/L)；空白对照组加入 100?L含体积分数为 1%吐温 80?的 RPMI-1640 培养液。药物和细胞作用24、48、72?h 后，每孔加入四氮唑化物 (MTT)10?L(5?g/L)，37?孵育后于 570?nm 波长处用酶联免疫检测仪测其 D 值，计算细胞生长抑制率() 。 【结果】莪术油对 HL-60、K562 细胞的生长抑制作用随着作用时间的延长明显增加，24、48 、72?h 的抑制率之间差异有显著性(001)；莪术油对 HL-60、K562 细胞的生长抑制作用随着药物浓度的增加而增加，400、 200、 100、50?mg/L 的抑制率比较有显著性差异(001)。但莪术油对 HL-60、K562 两种细胞的生长抑制作用比较无显著性差异(005) 。 【结论】莪术油对 HL-60、K562 细胞的生长有抑制作用，且其抑制作用与药物浓度和作用时间相关。 关键词：莪术/药理学；莪术油/ 药理学；白血病/中药疗法；HL-60 细胞/药物作用；K562 细胞/药物作用 莪术油在实体瘤的治疗中已取得较满意的效果，近年来也有2用莪术油治疗白血病的临床报道 ，但至今莪术油对白血病的作用机理尚不清楚。本研究通过观察在不同药物浓度和不同作用时间条件下，莪术油对白血病细胞株 HL-60 和 K562 细胞的抑制作用，比较莪术油对不同白血病细胞株的敏感性，以评估该药物用于治疗白血病的临床意义和价值。 1 材料 11 主要试剂 莪术油：广东省中医院制剂室提供；吐温 80：美国 Sigma公司产品；RPMI-1640 培养液：德国 Gibco 公司产品；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司产品；四氮唑化物(MTT)：美国 Sigma 公司提供。 12 主要实验仪器 超净工作台：北京伟达净化厂生产；二氧化碳培养箱：美国NAPCO 公司产品；恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器厂生产；倒置显微镜：日本 NIKON 公司产品；超低温冰箱：日本 SANYO 公司生产；电子分析天平：德国 DENNER 公司产品；96 孔培养板：美国 Costar 公司产品； 5810R 离心机：德国 EPPENDORF 公司产品。13 主要试剂配制 RPMI-1640 培养液：取 RPMI-1640 粉剂 104?g 加入三蒸水 1000?mL,NaHCO20?g，Hepes27?g，测 pH 值为 73，滤过除菌分装；新生牛血清：56?水浴 30?min 灭活后分装，-20?3保存；5?g/LMTT 染液：200?mgMTT 充分溶解于40?mL001?molL磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)，滤过除菌后 4?避光保存；含体积分数为 1%吐温 80 的 RPMI-1640培养液：取 99?mLRPMI-1640 培养液，加入 1?mL 吐温 80，滤过除菌，4?避光保存备用；莪术油液：取 08?mL?1?g/L 莪术油，10?mL 吐温 80，9892?mLRPMI-1640 培养液，配成 800?mg/L莪术油(含 1%吐温 80)。再依次配成 400、 200、100?mg/L 莪术油(均含 1%吐温 80)。 14 细胞株 HL-60、K562 细胞，购自武汉大学中国典型物保藏中心，体外培养于含体积分数为 10%新生牛血清的 RPMI-1640 培养液中，置 37、体积分数为 5%的 CO培养箱中培养。2 方法 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT 法)原理：活细胞线粒体中存在与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)相关的脱氢酶，可将黄色的四氮唑化物(MTT)还原为不溶性的蓝紫色的甲瓒(Formazan)，死细胞中此酶消失， MTT 不被还原。用二甲基亚砜(DMSO)溶解 Formazan 后可用酶标仪在 570?nm 波长处检测光密度(） 。 取对数生长期的 HL-60、?K562 细胞，? 传代接种于 96 孔板，?每孔 100?L?( /孔)，?同时每孔分别加入不同浓度的莪术油液 100?L?(终浓度分别为 400、?200、?100、?50?mg/L) ；?空白对照组加入 100?L含体积分数为 1%吐温 80 的 RPMI-16404培养液。?每一浓度设 3 个复孔。?药物和细胞作用24、?48 、?72?h 后，?每孔加入 MTT10?L(5?g/L)，?37?孵育4?h，?2000?r/min 离心 5?min，?弃上清，? 每孔加入DMSO100?L，?37空气浴摇床振荡 20?min 后于 570?nm 波长处用酶联免疫检测仪测其 D 值，?计算细胞生长抑制率?(RI） 。? （加药组/对照组）? 。?实验重复 3 次。统计方法：数据分析采用 SPSS80 统计软件处理，采用 析因分析。 3 结果 不同浓度、作用时间的莪术油对 HL-60、K562 细胞的抑制率见表 1。表 1 不同浓度、作用时间的莪术油 (OCA)对 HL-60、K562 细胞抑制率的影响（略） MTT 结果显示，不同浓度的莪术油对 HL-60、K562 细胞的生长均具有抑制作用。统计分析显示，莪术油对 HL-60、K562 细胞的生长抑制作用随着作用时间的延长明显增加，24、48 、72?h的抑制率之间比较有显著性差异(001)；莪术油对 HL-60、K562 细胞的生长抑制作用随着其浓度的增加而增加，400、 200、 100、50?mg/L 的抑制率之间比较有显著性差异(001)。但莪术油对 HL-60、K562 两种细胞的生长抑制作用比较无显著性差异(005)。 4 讨论 5莪术油是从中药莪术中提取的有效成分。它具有莪术活血祛瘀、消积止痛的功效，是能进行静脉注射的新型制剂。在众多抗癌中药中，莪术的研究开展最早，研究最多1-5 。有研究显示，莪术油除具有细胞毒作用外，还具有免疫调节功能，能诱导淋巴因子激活杀伤细胞(LAK) 产生 。时继慧等报道，莪术油含有 榄香烯、莪术醇、莪术二酮等多种抗癌成分，具有增强免疫功能的作用，能升高白细胞计数，对骨髓正常造血细胞有保护作用。尽管临床有莪术油治疗小儿急性白血病取得较好疗效的报道，但该药物对白血病细胞(CFUL)的作用机理至今未明。本研究观察了莪术油对 HL60 和 K562 细胞的作用，结果表明，莪术油对 HL60 和K562 细胞有良好的生长抑制作用，且随着莪术油药物浓度增加和对细胞作用时间的增加，抑制率明显升高。因此推测，莪术油治疗白血病的作用机理可能在于抑制白血病细胞的生长。由此认为临床使用莪术油注射液治疗白血病，既可抑杀白血病细胞，又可保护正常造血干细胞的损伤，可作为自体造血干细胞移植体外净化药物，使移植物体外净化更彻底。 参考文献： 吴万垠，罗云坚，程剑华，等莪术油肝动脉灌注治疗大鼠移植性肝癌 华人消化杂志，1998，6(10) ：859 吴万垠，罗云坚，程剑华，等莪术油对小鼠肝癌细胞 DNA 作用的图像分析 中西医结合肝病杂志，1999，9(1)：18 6石灵春，吴万垠，张维彬，等莪术油对小鼠肝癌增殖细胞核抗原的影响 世界华人消化杂志，1999，7(2)：156 施广霞，郭连英，刘金友，等抗肿瘤的实验研究：-榄香烯抗 Ca76186 乳腺癌的实验研究 大连医学院学报，1994，16(3)：161 许洪霞温莪术抗肿瘤有效成份的研究 中草药通讯，1979，10(10)：1 钱振超，刘金友，赵肃荣，等莪术瘤苗的主动免疫保护效应莪术抗癌作用原理的探讨 药学学报，1991(12)：892 钱振超，?王大庆，?金成钢，?等? 瘤苗特异性主动免疫治疗及其机制的实验研究? ?中国肿瘤生物治疗杂志，?1995，?2?(2)：?120 时继慧，李成章莪术油升高白细胞作用的研究 中药通报，1981(2)：32