Real timePCR引物 引物设计原则 1 引物长度一般为15 30个核苷酸 引物过短会使PCR的特异性降低 过长会提高相应的退火温度 并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74 亦会影响产物的生成 且合成引物的成本增加 2 引物中的碱基尽可能随机分布 避免出现嘌呤 嘧啶的堆积现象 尤其是引物的3 端不应有连续3个G和C 否则会使引物在模板的G C富集序列区错误配对 引物中G C的含量在45 55 左右 设计引物时要考虑3 端和5 端引物具有相似的Tm值 Tm 4 G C 2 A T 引物长度要确保解链温度不低于54 C3 引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构 按经验 引物自身存在的连续互补序列 一般不超过3bp 4 两个引物之间不应存在互补序列 尤其应避免3 端的互补重叠 5 引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性 尤其是引物3 末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列 否则易导致非特异性扩增 6 引物3 端碱基是引发延伸的起点 因此一定要与模板DNA配对 引物3 端的最佳碱基选择是G和C 因为它们形成的碱基配对比较稳定 7 引物的5 端可以修饰 如附加限制酶位点 引入突变位点 用生物素 荧光物质 地高辛标记 加入其它短序列包括起始密码子 终止密码子等 在PCR的起始反应中 引物5 端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力 但在后续的扩增循环中 这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去 所以如此引物参与的PCR产物 既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列 引物设计原则 RT引物的茎环序列5 GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC 3 茎环序列 前 粘附序列 后 构成miRNA的RTprimer5 GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACAACC 3 成熟序列反义连3 端后6 8个碱基做为RT引物的粘附序列部分ACAACC 上游引物 下游引物 RT引物分析 粘贴的成熟序列反义链端不在颈环结构中 可用