1 2 第二章分子发光分析 分子 吸收能量 激发为激发态 释放出能量 基态 电能 化学能 光能 称为 发光 光的形式释放 荧光 磷光 分子发光 光致发光 化学发光 辐射跃迁 非辐射跃迁 以热的形式释放 4 基态单重态S 激发态单重态S 激发态三重态T 激发单重态S与激发三重态T的不同点 S是抗磁分子 T是顺磁分子 tS 10 8s tT 10 4 1s 发光速度很慢 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁 基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁 激发三重态的能量较激发单重态的能量低 5 其中S0 S1和S2分别表示分子的基态 第一和第二电子激发的单重态 T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态 V 0 1 2 3 表示基态和激发态的振动能级 2 分子内的光物理过程 6 振动弛豫 在同一电子能级中 电子由高振动能级转至低振动能级 而将多余的能量以热的形式发出 发生振动弛豫的时间为10 12s数量级 非辐射能量传递过程 7 内转移 当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时 常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级 S1转移S2 8 系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁 例如S1 T1就是一种系间窜跃 通常 发生系间窜跃时 电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处 9 辐射能量传递过程 荧光发射 电子由第一激发单重态的最低振动能级 基态 得到最大波长为 3的荧光 由图可见 发射荧光的能量比分子吸收的能量小 3 2 1 10 磷光发射 电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小 因为这是禁阻跃迁 但是 由第一激发单重态的最低振动能级 有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态 再经过振动驰豫 转至其最低振动能级 由此激发态跃回至基态时 便发射磷光 这个跃迁过程 T1 S0 也是自旋禁阻的 其发光速率较慢 约为10 4 10s 因此 这种跃迁所发射的光 在光照停止后 仍可持续一段时间 外转移指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移 使荧光或磷光强度减弱甚至消失 这一现象称为 熄灭 或 猝灭 荧光与磷光的根本区别 11 磷光是由激发三重态最低振动能层至基态 荧光是由激发单重态最低振动能层至基态 区别 二 荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱 ex 以不同波长的入射光激发荧光物质 在荧光最强的波长处测量荧光强度即以激发光波长为横坐标 以荧光强度为纵坐标绘制曲线即可得到激发光谱曲线 发射光谱 em 固定激发光波长 最大 然后测定不同的波长时所发射的荧光强度即可绘制荧光发射光谱曲线 12 在荧光的产生过程中 由于存在各种形式的无辐射跃迁 损失能量 所以它们的最大发射波长都向长波方向移动 以磷光波长的移动最多 而且它的强度也相对较弱 13 14 15 激发光谱与发射光谱的关系 a Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值 发射光谱的波长比激发光谱的长 振动弛豫消耗了能量 b 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级 吸收不同波长的能量 如能级图 2 1 产生不同吸收带 但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态 产生波长一定的荧光 c 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱 与激发光谱形状一样 成镜像对称关系 三 荧光的影响因素分子产生荧光必须具备两个条件 分子必须具有与所照射的辐射频率 紫外 可见光 相适应的结构 共轭双键 才能吸收激发光 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后 必须具有一定的荧光量子产率 16 1 荧光效率它表示物质发射荧光的能力 通常用下式表示 17 荧光效率越高 物质发射荧光越强 kf为荧光发射过程的速率常数 与化学结构有关 ki为其它有关过程的速率常数的总和 化学环境 凡使kf值升高而使ki值降低的因素 都可增强荧光 2 荧光与有机化合物结构的关系 1 跃迁类型实验证明 对于大多数荧光物质 首先经历 激发 然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁 再发生 跃迁而得到荧光 2 共轭效应实验证明 容易实现 激发的芳香族化合物容易发生荧光 增加体系的共轭度荧光效率一般也将增大 主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数 有利于产生更多的激发态分子 18 3 刚性平面结构实验发现 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光 因为这种结构可以减少分子的振动 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少 也就减少了碰撞去活的可能性 19 20 4 取代基效应 芳环上取代基 给电子基团 荧光增强 OH OR CN NH2 产生了p 共轭作用 增强了 电子共轭程度 使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大 吸电子基团 减弱甚至会猝灭荧光 如 COOH NO C O 卤素 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低 在重原子中 能级之间的交叉现象比较严重 因此容易发生自旋轨道的相互作用 增加了由单重态转化为三重态的速率 3 金属螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子 在溶液中只能发生无辐射跃迁 因而不产生荧光 不少有机化合物虽然具有共轭双键 但由于不是刚性结构 分子处于非同一平面 因而不发生荧光 但是 若这些化合物和金属离子形成螯合物 随着分子的刚性增强 平面结构的增大 常会发生荧光 21 22 23 同一种荧光物质溶于不同溶剂 其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同 4 溶剂效应 一般情况下 随着溶剂的极性的增加 荧光物质的 跃迁几率增加 荧光强度将增强 荧光波长也发生红移 5 温度的影响 一般说来 大多数荧光物质的溶液随着温度的降低 荧光效率和荧光强度将增加 如荧光素的乙醇溶液在0 以下每降低10 荧光效率增加3 冷至 80 时 荧光效率为100 四 溶液的荧光 或磷光 强度1 荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率 If Ia式中 为荧光量子效率 又根据Beer定律A lgI I0I I0 10 AIa I0 I I0 1 10 A I0和I分别是入射光强度和透射光强度 代入上式得If I0 1 10 kbc 24 整理得 If 2 3 I0kbc当入射光强度I0和b一定时 上式为 If Kc即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比 但这种线性关系只有在极稀的溶液中 当kbc 0 05时才成立 对于较浓溶液 由于猝灭现象和自吸收等原因 使荧光强度和浓度不呈线性关系 25 26 2 影响荧光强度的环境因素 因素 溶剂 一般溶剂效应 折射率和介电常数的影响 特殊溶剂效应 荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用如氢键的生成 同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同 温度 温度上升使荧光强度下降 内部能量转化作用增大 碰撞频率增加 使外转换的几率增加 酸度 化合物所处状态不同 电子构型上有所不同 荧光强度和荧光光谱不同 27 28 3 荧光猝灭 定义 荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象 类型 碰撞猝灭 激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞 荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态 静态猝灭 荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的络合物 转入三重态的猝灭 发生电子转移反应的猝灭 猝灭剂与荧光物质 荧光物质的自猝灭 浓度较高单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭 溶解氧与荧光物质 29 光源 氙灯和高压汞灯 激发单色器 光栅 扫描激发光谱 选择激发波长 样品池 I0 I If 发射单色器 扫描发射光谱 消除其它光线的干扰获得所需的荧光 检测器 显示器 与分光光度计的差别 两个单色器 两个单色器互成直角 光电倍增管 二 荧光分析仪 30 三 分子荧光分析法及其应用 1 荧光分析方法的特点 1 灵敏度高 2 选择性强 3 试样量少和方法简单 4 提供比较多的物理参数 2 荧光定量分析的方法 方法 标准曲线法 荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系 比较法 同样条件下 测定试样溶液和一标准溶液的荧光强度 直接通过比例计算 31 3 荧光分析法的应用 方法 直接荧光法 被测物本身有荧光 被测物与试剂反应后 F与物质的浓度成正比 荧光猝灭法 被测物使荧光熄灭 由荧光强度降低的强度来测定被测物的含量 间接荧光法 某些阴离子夺取金属络合物中金属离子 而释放出能发荧光的配位体 催化荧光法 反应速度慢 荧光微弱 难测定 金属离子将加速反应进行 32 磷光分析法 1 如何获得较强的磷光 增加试样的刚性 低温冷冻 固体磷光法 吸附于固相载体 滤纸 分子缔合物的形成 加入表面活性剂等 重原子效应 加入含重原子的物质 如银盐等 敏化磷光 通过能量转移产生磷光 磷光发射 电子由第一激发三重态的最低振动能级 基态 T1 S0跃迁 电子由S0进入T1的可能过程 S0 T1禁阻跃迁 33 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量 在有荧光发射的同时测量磷光 磷光分析仪器 应用 34 化学发光分析法 一 基本原理 A B C D D D h 某些化合物接受能量而被激发 从激发态返回基态时 发射出一定波长的光 1 能够发光的化合物大多为有机化合物 芳香族化合物 2 发光反应多为氧化还原反应 激发能与反应能相当 E 170 300kJ mol 位于可见光区 3 发光持续时间较长 反应持续进行 发光反应如果存在于生物体 萤火虫 中 称生物发光 35 化学发光效率 化学效率 发光效率 化学反应所决定 化学反应和环境因素 化学发光强度 单位时间发射的光量子数 dc dt是分析物参加反应的速率 36 若化学发光反应是一级动力学反应则 即发光总强度与被测物浓度成线性 二 化学发光反应类型 1 直接化学发光和间接化学发光 直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应 生成电子激发态产物分子 此初始激发态能辐射光子 A B C DC C h 37 间接发光是被测物A或B 通过化学反应生成初始激发态产物C C 不直接发光 而是将其能量转移给F 使F跃迁回基态 产生发光 A B C DC F F EF F h 2 气相化学发光和液相化学发光 1 气相化学发光 化学发光反应在气相中进行 主要有O3 NO S的化学发光反应 可用于监测空气中的O3 NO SO2 H2S CO NO2等 NO O3 NO2 NO2 NO2 h 38 2 液相化学发光 化学发光反应在液相中进行 应用最多的发光试剂 鲁米诺 3 氨基苯二甲酰肼 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程 鲁米诺 H2O2发光反应反应速度慢 可检测低至10 9mol L的H2O2 39 生物发光 生物发光是化学发光中的一类 特指在生物体内通过化学反应产生的发光现象 主要由酶来催化产生的 多种细菌 昆虫 鱼类等均能发光 40 荧光灯 当高压加在灯管两端后 灯管内少数电子高速撞击电极后产生二次电子发射 开始放电 管内的水银受电子撞击后 激发辐射出253 7nm的紫外光 产生的紫外光激发涂在管内壁上的荧光粉而产生可见光 可见光的颜色将依据所选用的荧光粉的不同而不同 41 荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成 过氧化物 酯类化合物和荧光染料 简单地说 荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应 将反应后的能量传递给荧光染料 再由染料发出荧光 目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层 夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物 经过揉搓 两种化合物反应使得荧光染料发光 42 三 化学发光的测量仪器 仪器主要包括 样品室 光检测器 放大器和信号输出装置等部件 43 荧光法测定维生素B2片剂中核黄素含量 一 实验目的 1 学习和掌握荧光光度分析方法 2 了解荧光分光光度计的结构及使用方法 二 实验原理 维生素B2结构式 维生素B2 又叫核黄素 橘黄色 无臭的针状晶体 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂 在中性或酸性溶液中稳定 光照易分解 对热稳定 44 维生素B2水溶液在430 440nm蓝光或紫外光照射下会发生绿色荧光 荧光峰在535nm 在pH 6 7溶液中荧光强度最大 在pH 11的碱溶液中荧光消失 所以可以用荧光光谱法测定维生素 2的含量 三 实验用品 1 仪器 荧光分光光度计 移液管 容量瓶 棕色试剂瓶 比色管