1豚鼠耳蜗核 SP 阳性神经元向下丘的投射HRP 逆行追踪与免疫组化双标作者：邱建华乔莉刘顺利黄维国王锦玲 【关键词】 P 物质 关键词: P 物质;辣根过氧化物酶;耳蜗核;免疫组织化学 摘 要:目的 研究豚鼠耳蜗核 P 物质（SP）免疫反应阳性产物的分布特点及 SP 标记神经元向下丘投射方式. 方法 采用辣根过氧化物酶（HRP ）逆行追踪及免疫组织化学技术. 结果 SP 免疫反应（SP-IR）阳性的纤维和终末主要分布在耳蜗背侧核，而 SP-IR 阳性神经元主要分布在耳蜗腹侧核，在腹侧核尚可见 SP 阳性终末包绕SP 阳性胞体形成环形结构. 一侧下丘中央核注入 HRP 后，对侧耳蜗核 HRP 标记细胞分布于耳蜗前腹核及背侧核，耳蜗后腹核呈阴性反应. 同侧耳蜗后腹核 HRP 标记神经元数量也较少.在对侧耳蜗前腹核，HRP-SP 双标神经元约占标记细胞的 44%，SP 单标细胞占标记细胞的 50%，HRP 单标细胞占 6%.耳蜗背侧核内侧也可见少量的双标细胞. 结论 SP 是耳蜗核上行投射神经元的递质或调质. Keywords:substance P;horseradish peroxidase;cochlear nucleus;immunohistochemistry 2Abstract:AIM To study the distribution characteristics of substance P（SP）immunoreactive（SP-IR）positive neurons in cochlear nucleus and projection pattern of labeled neurons and SP-HRP double labeled neurons from cochlear nucleus toinferior colliculus（IC ）.METHODS Immunohistochemistry and horseradish peroxidase（HRP ）retrograde tracing tech-nique were used in this study.RESULTS SP-IR positive fibers and endings were distributed mainly in dorsal cochlear nucleus（DCN ）.But SP-IR positive neurons mainly in ven-tral cochlear nucleus（ VCN）.The circular structure of SP positive terminals around the SP positive neurons also was seen in VCN.When HRP was injected into the central nucle-us of IC，HRP-labeled neurons were distributed mainly in an-teroventral cochlear nucleus（AVCN）and DCN of contralat-eral cochlear nucleus， but posteroventral cochlear nucleus（PVCN）was negative.The number of HRP-labelled neurons in PVCN of ipsilateral was few.In contralateral AVCN HRP-SP double labeled neurons were44%，SP labeled neu-rons were50%and HRP labeled neurons were6%.CONCLUSION SP may be one of neurotransmitter or mod-ulator of auditory ascending projection. 30 引言 P 物质（ SP）作为初级感觉神经递质已为很多实验所证实.新近的研究表明，Corti 器内毛细胞底部广泛分布 SP 和 SP 受体免疫反应阳性的神经纤维及末梢1，2 .HRP 追踪结合 SP 免疫反应双标的研究也证实，在豚鼠螺旋神经节有两种不同类型的 SP 阳性神经元向耳蜗核投射3 .结果证实 SP 是一种耳蜗的传入神经信息物质.为探讨豚鼠耳蜗核 SP 阳性神经元的分布状态及是否作为次级听觉信号传入神经递质或调质，我们采用下丘注入辣根过氧化物酶（HRP）逆行追踪，结合耳蜗核内 SP 免疫反应阳性神经元的双标研究，从形态学方面提供 SP 作为听觉信号次级传入神经元的神经递质及调质的进一步证据. 1 材料和方法 1.1 材料 耳廓反射灵敏，体质量 320380g 健康杂色豚鼠20 只，雌雄不拘.戊巴比妥钠（ 30mgkg-1 ）腹腔麻醉后，置于脑立体定向仪上.按邵殿华等4 的方法对下丘进行立体定位. 定位后行颅骨钻孔，用玻璃微管（外径 35m）缓慢加压注入300gL-1 HRP（Sigma，RZ=3.14）2L. 41.2 方法 动物存活 48h 后，再用过量戊巴比妥钠腹腔麻醉，开胸经心动脉插管，生理盐水冲出血液，1.33molL-1 多聚甲醛加 50mmolL-1 戊二醛 800mL 灌注固定.断头后，剥除颅骨，取下脑干，用 1.33molL-1 多聚甲醛再固定4h，然后置于 0.73molL-1 蔗糖磷酸缓冲液（pH7.4，4）直至沉底 .耳蜗核行 40m 连续冰冻切片，每隔两张切片分成 1 组，共分 3 组，分别行 SP 免疫组化反应 1 .HRP反应3 及 HRP-SP 反应.后者先行 HRP 反应，再行 SP 免疫组化反应.免疫组化对照试验用同等稀释度的正常家兔血清稀释液替代SP 抗体，其他试剂及步骤不变. 2 结果 2.1 耳蜗核 SPIR 阳性物的分布 在耳蜗核内可见大量呈串珠状的阳性纤维及终末，纤维粗细不同，多数含有明显的膨体，相互交织呈网状.背侧核的纤维及终末密度大于腹侧核.SP 阳性神经元主要分布在耳蜗前腹核及后腹核，呈圆形、椭圆形、大小不等.耳蜗背侧核的内侧部也可见 89 个 SP-IR 阳性神经元（Fig1 ）. 在耳蜗前腹核，SP 阳性神经纤维行径弯曲，膨体较少，阳性终末呈棕黄色点状颗粒，并可见 SP 阳性终末包绕 SP 阳性神经元呈环状分布（Fig2）. 2.2 HRP 耳蜗核逆行标记神经元的分布 左侧下丘注入5HRP，逆行标记细胞分布在右侧耳蜗前腹核、耳蜗背侧核和左侧的耳蜗后腹核，用钨酸钠-四甲基联苯胺（TMB）呈色后，标记细胞呈蓝绿色，大小不等，形态各异.在耳蜗背侧核，HRP 标记细胞体积较大，有多个突起，主要分布在颗粒细胞层，呈半环形结构.耳蜗前腹核 HRP 标记细胞呈团状，分布密集，几乎占据整个前腹核（Fig3）. 2.3 耳蜗核 SP 阳性神经元向下丘的投射 左侧下丘注入 HRP结合耳蜗核 SP 免疫组化反应表明，在右侧的耳蜗前腹核可见数量较多的 HRP-SP 双标记细胞（Fig4） ，约占耳蜗前腹核标记细胞的44%，SP 单标细胞占标记细胞的 50%，HRP 单标细胞占标记细胞的 6%.HRP-SP 双标细胞可分成两型:I 型细胞数量较多，呈圆形，体积较大，含多个突起;II 型细胞数量较少，多呈椭圆形或梭形，体积较小（Fig5，6） ，在耳蜗背侧核的内侧部可见数量较少的 HRP-SP双标细胞. 3 讨论 耳蜗核是听觉传入通路重要的中继核团，解剖上分为耳蜗背侧核，耳蜗前腹核和耳蜗后腹核，均接受 来自螺旋神经节细胞的投射. 本研究在正常豚鼠耳蜗核内，发现广泛分布的 SP-IR 阳性的神经纤维及终末，纤维粗细不均，多数含有明显的膨体.我们以前的研究6中发现豚鼠蜗轴各回螺旋神经节均有 SP-IR 阳性神经元，约占螺旋神经节细胞的 50%，听神经内也可见两种粗细不同 SP-IR 阳性的神经纤维，螺旋神经节有 SP-IR 阳性神经元向耳蜗核投射.尽管耳蜗传出神经的橄榄耳蜗束也有纤维向耳蜗核投射5 ，但尚未见上橄榄复合体含有 SP 阳性神经元的报道. 这些结果均提示，耳蜗核团SP-IR 阳性的纤维及终末，主要来自螺旋神经节阳性神经元的中枢突及末梢.我们发现，豚鼠耳蜗背侧核 SP 阳性纤维及末梢的密度明显大于耳蜗腹侧核，间接地说明螺旋神经节 SP 阳性神经元，多数向耳蜗背侧核投射.但在耳蜗前腹核仍可见 SP 阳性的末梢包绕 SP 阳性的胞体形成环形结构，说明在耳蜗腹侧核，SP 阳性的终末与 SP 阳性的胞体可能有直接的联系.在耳蜗核，SP 阳性神经元主要分布在耳蜗腹侧核，在耳蜗背侧核的内侧部仅发现 8 9 个 SP 阳性神经元，这与 Wynne 等6 采用免疫荧光的方法在大鼠耳蜗核所发现的 SP阳性神经元的分布状态不相一致，后者在耳蜗腹侧核并没有发现 SP阳性神经元.这可能与动物种族的差异及方法的敏感性有关.在声信号传入的各级中枢均含有 SP 受体阳性的神经元7 ，SP 与其受体结合可能是声信号神经传导的重要基础之一. 我们研究表明，一侧下丘注入 HRP 后，耳蜗核逆行标记细胞主要分布在对侧的耳蜗背侧核及前腹核，同侧的耳蜗后腹核也有少量分布. 这一结果充分提示耳蜗核经斜方体交叉投射至对侧下丘的主要亚核是耳蜗背侧核和前腹核，而在耳蜗背侧核主要是颗粒细胞层的7神经元.有研究报告8 在耳蜗核内微量注入 SP 抗体后，耳蜗核的听觉诱发电位的峰值振幅明显降低，潜伏期明显延长.采用细胞内记录的电生理方法及听觉核团脑片技术，发现 SP 可增加峰值电位并产生向细胞内的内向电流9 .表明 SP 参与声信号传递及调节.结合耳蜗核 SP 免疫反应发现，耳蜗前腹核 HRP-SP 阳性双标细胞占标记细胞的 44%，提示在耳蜗前腹核向下丘的投射中，SP 能神经元具有重要的作用.此外，豚鼠耳蜗背侧核和腹侧核均含有谷氨酸免疫反应阳性神经元及受体11，12 ，但耳蜗核内 SP 阳性神经元与谷氨酸阳性神经元之间的相互关系尚不清楚，但据分布状态及数量来看，耳蜗核在向高位听觉中枢的传递过程中，SP、谷氨酸阳性神经元可能都具有重要的作用. 图 1 图 6 略 参考文献: 1Qiu JH，Wang JL，Shi JW，Li YQ，Liu SL.Immunohis-tochemical distribution of SP and SP receptor in the cochlea ofguinea pigs J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil MedUniv） ，1996;17（1）:1-4. 2Schickinger B，Ehrenberger K，Felix D，Heiniger-Bucki C，Im-boden H，Davies WE，Felix H.Substance P in the auditory hair cells in the guinea pig J.ORL J Otorlino-laryngol Relat Spec，1996;58 （3）:121-126. 8 3Qiu JH，Wang JL，Liu SL，Shu SY.Morphological characteris-tics and projection of SP positive neurons in spiral ganglion of guinea pigs J.Linchuang Er-bi Yanhouke Zazhi（J Clin Oto-laryngol） ，1992;27 （2）:67-69. 4Shao DH，Qian XB.Stereo