趋化因子研究进展北京大学医学部韩文玲 简介 目前 近50种趋化因子得以发现 成为最大的细胞因子亚家族 趋化因子及其受体具有重要的生理意义和病理作用 在炎症 肿瘤 AIDS等疾病中发挥重要作用 趋化因子相关产品已经进入临床研究 成为新的生物治疗热点 趋化因子的理论和应用研究是目前生命研究的热点之一 趋化因子研究的迅速发展 趋化因子研究的标志性成果 一 趋化因子 一 概念 趋化因子 chemokines chemoattractantcytokines CK 是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子 趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动 二 命名 早期 根据CK来源 靶细胞 结构特征而命名 TARC ThymusandActivation RegulatedChemokine胸腺和活化调节的趋化因子STCP 1 MDC StimulatedTCellChemoattractantProtein 1 活化T细胞趋化蛋白 1 Macrophage DerivedChemokine 巨噬细胞来源的趋化因子 1999年 国际命名委员会根据CK的结构特征命名 绝大多数CK有4个保守的半胱氨酸 Cys 根据前两个Cys的相对位置不同 可以分为CXC CC C 和CX3C 趋化因子 分别用CXCLn CCLn XCLn和CX3CLn代表CXC CC C和CX3C家族CK L为Ligand 迄今发现的CK有CXCL1 16 CCL1 28 XCL1 2和CX3CL1 CCL17 TARC CCL22 STCP 1 MDCCK基因的命名 SCYn SmallInducibleCytokineGeneSCYAn CC SCYBn CXC SCYCn C SCYDn CX3C CK受体的命名规则与此相似 用R即Receptor代替L 目前发现的CK受体有CCR1 11 CXCR1 6 XCR1和CX3CR1 http gene bjmu edu 三 趋化因子的分类 1 根据蛋白质的一级结构进行分类 CXC 趋化因子 CC 趋化因子 C 趋化因子 CX3C 趋化因子 C为半胱氨酸 X为任意氨基酸 1 CXC 趋化因子 根据该家族CK第一个Cys前是否有ELR glutamicacid leucine arginine 谷氨酸 亮氨酸 精氨酸 结构 分为 ELRCXC趋化因子 ELRCXC C C CXCL8 IL 8等 趋化Neu 不能趋化Mo 促进血管的生成 非ELRCXC趋化因子 CXC C C CXCL12 SDF 1等 趋化Lymphocyte或HPC 抑制血管的生成 同源性 CXC家族CK之间 25 90 染色体定位 CXCL1 11 4q21 CXCL12 10q11 CXCL13 5q31 CXC趋化因子的名称 染色体定位及受体 2 CC 趋化因子 分类 4CysCC趋化因子 包括多数CCCKs CC C C 6CysCC趋化因子 CCL15 Lkn 1 CCL21 SLC 6Ckine CC C C C C 趋化谱 T B Mo Bas Eos Neu等 同源性 CC成员之间 25 70 定位 CCL1 16 18 23 17q11 12 CCL17 22 16q13 CCL19 21 25 27 9p13 CC趋化因子的名称 染色体定位及受体 CC趋化因子在17号染色体上成基因簇形式存在 3 C 趋化因子 结构 C C 2 4位Cys Ltn1 2 lymphotactin 淋巴细胞趋化素 两个成员 趋化谱 T BMC定位 1q23 4 CX3C 趋化因子 结构 CXXXC C C Fractalkine neurotactin 分形素 神经趋化素 唯一一个CX3C成员 为膜结合型CK 趋化谱 膜型 Mo T 重组的趋化因子功能区 Neu 定位 16q13 与CCL17 22紧密连锁 2 根据来源和功能分类 1 组成性 淋巴组织 自稳性趋化因子 定义 胸腺 淋巴结 脾脏中组成性高表达的CK 靶细胞 初始T细胞 胸腺细胞 记忆细胞 功能 在淋巴细胞的发育 成熟 归巢和再循环过程中发挥重要作用 皮肤 小肠 粘膜组织中也表达此类CKs 与组织特异性淋巴细胞归巢有关 自稳性趋化因子的组织表达 2 诱导性表达趋化因子 炎性趋化因子 定义 在LPS IL 1 TNF 等刺激下产生的CK 靶细胞 效应细胞 功能 防御功能 反应过度时 有破坏作用 趋化因子的表达模式 炎性趋化因子和自稳性趋化因子成员 受体及靶细胞 3 其它具有趋化活性的细胞因子 IGF 1 FGF HGF等细胞因子具有趋化活性 但它们的主要作用不是趋化作用 不列为CKs 1 CKs分子量小 在8 12KD之间 2 蛋白质一级结构上具有同源性 CXC与CC成员之间 20 30 四 趋化因子的共同结构特点 3 多数CKs含有4个保守的Cys 1 3位Cys 2 4位Cys形成功能必须的两对二硫键 4 CKs有2个 螺旋 3个 折叠 CXCL12 SDF 1的空间构型图 NMR 5 不同CKs具有相似的空间结构 趋化因子的结构 定位及组成 二 趋化因子受体 趋化因子受体属于7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族 GPCRs G proteincoupledreceptors 1 7次跨膜 C端位于胞内 有Ser Thr位点 参与信号转导 一 趋化因子受体的特点 2 不同CKR之间具有同源性 3 胞内区与G蛋白偶联 G蛋白由 组成 4 亚单位具有GTP结合位点和GTP酶活性 5 CKR未与CK结合时 呈聚合状态 与GDP结合 与CK结合后 与GTP结合 游离 活化下游效应物 6 与CKR偶联的G蛋白有多种 与趋化运动有关的G蛋白 亚单位多为PTX敏感的G I 二 趋化因子受体的分类1 根据结合配体的不同 分为CXCR CCR XCR CX3CR 2 根据特异性不同 分为特异性受体 共享性受体 杂合性受体 DARC Duffy血型抗原 红细胞趋化因子受体 孤儿受体 病毒受体等 三 趋化因子受体的表达1 CKR有其相对特异的表达谱 CXCR4 Neu Mo CCR3 Eos Bas DARC RBC 趋化因子受体 配体及靶细胞 2 CKR的表达具有时 空特异性 1 在Th细胞的不同阶段 表达不同的CKR Na veTh CCR7 CXCR4 Th0 CCR7 CCR5 CXCR3Th1 CCR5 CXCR3 Th2 CCR3 4 8 CXCR4 2 CKR在DC迁移和功能成熟中具有不同的表达模式 非成熟DC CCR1 CCR2 CCR5 CXCR4 易于向炎症部位聚集 摄取抗原负载抗原的成熟DC CCR4 CCR7 CXCR4 便于向淋巴组织迁移 TLR调控DC细胞CKR的表达 四 CKR的信号传导途径 IL 8 IL 8R GDP GTP TPK PLC 2 3PI 3K IP3 DAG Ca2 PKC PKB MAPK CKR的信号传导途径 三 趋化因子的基本功能 一 趋化作用 二 上调整合素的表达 活化白细胞 三 促进细胞脱颗粒和生物活性物质释放 CCL2 MCP 1 Bas释放组织胺 CXCL8 IL 8 Neu产生活性物质 呼吸爆发 四 调节血管生成 ELRCXC CCL2促进血管生成 CXCL10 CCL21 SLC抑制血管生成 趋化因子引起的细胞形态改变 趋化因子在白细胞迁移中的作用 CXCL8 IL 8的作用 五 生长因子活性 促进细胞增殖 四 趋化因子在免疫细胞发育 定位及免疫应答中的作用 一 CKs促进免疫细胞发育 成熟 1 CXCL12 SDF 1和CXCR4促进B细胞分化发育成熟 2 CCL25 TECK和CCR9 CXCL12 SDF 1和CXCR4 CCL22 MDC和CCR4等促进T细胞发育成熟 3 CCL3 4 MIP 1 和CCR1 CCR2 CCR5等促进非成熟DC向炎症部位聚集 摄取抗原 发生功能成熟 CXCL12 SDF 1和CXCR4促进B细胞分化发育成熟 HPC表达CXCR4 骨髓基质细胞产生CXCL12 SDF 1 CXCL12 SDF 1趋化HPC与基质细胞相互作用 促进HPC向B细胞发育 表达sIg 成熟B细胞对CXCL12 SDF 1反应性 离开骨髓 进入血循环 CCL25 TECK和CCR9 CXCL12 SDF 1和CXCR4 CCL22 MDC和CCR4等促进T细胞发育成熟 CCL22 MDC和CCR4促进DP与TEC作用 发生阴性选择或成熟为单阳性细胞进入外周 胸腺中表达的CK和CKR CCL3 4 MIP 1 和CCR1 CCR2 CCR5等促进DC成熟 二 CCL21 SLC CCL19 ELC和CCR7 CXCL13 BCA 1 BLC和CXCR5协助T B DC细胞在周围免疫器官中正确定位并相互作用 T CCR7 DC CCR7 B CCR7 CXCR5 TFH CXCR5T区HEV SLC ELC B滤泡区HEV BCA T与DC在T区作用 分化效应细胞 TFH与B在B区作用 协助Ab产生和类别转换 三 促进效应T细胞回到炎症和感染部位 1 TFH CXCR5 进入滤泡区 辅助B细胞产生抗体的类别转换 2 Th1 CCR5 CXCR3 进入病毒感染等炎症部位 3 Th2 CCR3 4 8 CXCR4 进入过敏反应部位 病原体决定免疫应答 四 CKs促进天然免疫细胞和活化的适应性免疫细胞相互作用 1 CKs使Th2活化与组织Eso聚集相联系 2 CTL活化 产生CKs Mo NK Granulocyte聚集 扩大杀伤效应 趋化因子与过敏反应中嗜酸细胞聚集 Th2细胞分泌的IL 4 IL 13与IL 1 TNF协同作用 促进Eotaxins 1 2 3 MCP 4产生 趋化Eos Bas CTL产生趋化因子白细胞聚集病毒感染部位 放大免疫反应 五 CKs协助记忆 效应T B细胞向特定组织归巢CLA T向皮肤归巢 CCL27 CTACK CCR10 CCL17 TARC CCR4 4 7hiT向小肠归巢 CCL25 TECK CCR9IgAASC向小肠粘膜归巢 CCL25 TECK CCR9IgGASC位于慢性炎症部位 CXCL9 Mig CXCR3 CXCL12 SDF 1 CXCR4T向粘膜归巢 CCL28 MEC 趋化因子及其受体在免疫应答中的作用 五 趋化因子调节造血 一 趋化造血前体细胞 调节骨髓造血功能 MIP 1 CCL3 MCP 4 CCL13 TECK CCL25等25种CKs抑制髓系造血 人MIP 1 CCL3与GM CSF和M CSF协同刺激骨髓造血 二 促进B前体细胞的发育 SDF 1 CXCL12 三 促进Eos前体细胞发育成熟 Eotaxin CCL11 六 趋化因子的常用研究方法 一 趋化实验 1 体内实验 皮下 腹腔 静脉注射 观察细胞浸润情况 繁琐 2 体外实验 最常用的方法是Boyden小室法 也称微孔滤膜法 48孔趋化小室 上层放靶细胞 下层放待检测因子 两层之间有聚炭膜隔开 简单易行 细胞类型膜孔径趋化时间Neu 3um30min Lymphocytes 5um120min Mo 8um90min 反应结束后 洗掉非特异结合细胞 固定 染色 记数 记数方法 高倍镜下每孔随机选5个视野 取平均值 趋化活性表示方法 通常以趋化指数 chemotaticindex CI 表示 CI指实验组细胞数与对照组细胞数 三个复孔的平均值 的比值 CI大于2有意义 Boyden小室示意图 A 微孔滤膜法示意图B 内皮细胞趋化结果 二 钙流实验 多数CK与受体结合后 胞内Ca2 Indo 1AM或Fura 2AM等是Ca2 螯合剂EGTA的衍生物 可特异高亲和Ca2 将靶细胞与荧光探针孵育 检测荧光强度变化 反映CK活性 三 功能实验 CXCCKs 弹性蛋白酶 葡萄糖醛酸酶释放检测 呼吸爆发实验 MIP 1 用骨髓造血干细胞集落形成实验 CCCKs 组织胺释放 七 新趋化因子cDNA的克隆技术 一