茉莉酸甲酯与水杨酸甲酯对水稻化感作用的诱导效应研究茉莉酸甲酯与水杨酸甲酯对水稻化感作用的诱导效应研究摘 要：杂草是作物生产的劲敌，利用作物本身产生化学物质抑制杂草的化感特性控制杂草是符合农业可持续发展的理想选择。本研究在国际上首次成功地利用植物防御信号物质茉莉酸甲酯和水杨酸甲酯诱导水稻产生化感作用。水稻经茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯诱导以后，根部能分泌化学物质强烈抑制临近稗草的生长。水稻化感品种（PI312777）和非化感品种（华粳仙1号）经诱导后均产生化感作用，但对非化感水稻品种的诱导效应更加显著。经诱导后的水稻叶片和茎的提取物也对稗草有化感作用。液相色谱（HPLC）分析表明：茉莉酸甲酯和水杨酸甲酯诱导水稻产生了新的化感物质，有些物质浓度显著增加。本研究的发现为利用化感作用控制稻田杂草提供了捷径，也为抗草育种提供了依据。关键词：信号物质；茉莉酸甲酯；水杨酸甲酯；诱导；化感作用；水稻 1 前言 水稻是中国最主要的粮食作物。杂草是水稻生产的大敌。在使用除草剂和人工除草的情况下，每年因杂草危害造成产量损失为12%，不进行除草杂草可导致50-60%的产量损失，甚至导致颗粒无收。为了控制杂草，发达国家使用大量的除草剂，发展中国家耗费大量的人力。使水稻生产成本大大提高。一些耕作方式的改变（如水稻直播、免耕、抛秧等技术的采用），使杂草问题更加突出。随着经济的发展，农民可以在农业以外的其它行业赚到更多的钱。劳动力成本的提高和农民越来越不愿意做辛苦而烦琐的工作，使得人力除草越来越少。水资源的缺乏和灌溉成本的提高使得传统可以用深水灌溉控制的一部分杂草也迅速滋生影响水稻产量。发达国家除草剂在农药总量中占了60%以上，大量使用除草剂产生的环境污染、杂草抗性出现和成本过高等负面影响已引起各国极大的关注。尤其是稻田使用除草剂容易造成对地下水的污染，这直接威胁到人类饮用水的安全。除草剂的大量使用还破坏整个生态系统的平衡，打破食物链和食物网关系。在中国，由于农民文化素质和技术水平不高，加上农作物和杂草比较相似，经常因使用除草剂不当而造成对农作物的伤害。稻田杂草控制必须在使用化学除草剂以外寻求替代途径。国内目前使用的除草剂基本上是从国外仿制，加入世界贸易组织后，使用进口除草剂将使成本大大提高。而国内自50年代开始便开始通过人工合成的手段开发除草剂，40 多年来收效甚微，至今仍然主要靠仿制。国外开发一个除草剂平均需要8-10年时间，耗资几亿美元。投放市场后杂草又很快形成抗药性。这一切说明中国不能走发达国家依靠大量使用除草剂控制杂草的老路。中国应对杂草进行生态控制。利用作物的化感特性控制杂草是符合可持续发展要求的一种新思路和新方法4，12。化感作用（allelopathy）是植物（含微生物）通过释放化学物质影响邻近植物生长发育的现象。自1985年美国科学家Dilday发现水稻具有通过释放化学物质控制稻田杂草的化感作用特性以来，水稻的化感作用引起了科学家们的广泛兴趣。在美国农业部的大力资助下，以Dilday为首的一批科学家投入水稻化感作用特性和抗草基因的筛选研究工作。1990年他发现有12个品种对美国主要稻田杂草ducksalad可以形成半径为18-20厘米的抑制圈，在这个圈内80-90%的杂草得到控制（12）。国际水稻所（IRRI）在FAO的支持下，开展水稻化感作用研究。日本、丹麦等国家相继开展水稻化感作用研究。水稻是目前发现具有化感作用农作物中最强的一种。由于水稻的化感作用是基因控制的遗传性状，具有化感作用的水稻品种能长期保持抗草作用，这使得应用它控制杂草非常简单，也不需要每年化额外的成本，农民很容易接受。所以，利用水稻本身产生的化感作用来控制杂草是极为理想的选择。我国水稻种质资源丰富，来源于不同基因库的水稻遗传群体和突变体材料在化感作用潜力上存在显著的基因型差异。这些差异可以应用遗传育种方法予以利用。在国内，水稻化感作用近年来也受到科学家们的重视，并不少研究报道4，5，7。探索病、虫、草害控制的新方法已经成为农业可持续发展的重大课题,提高作物的抗性是最重要的途径之一。植物的诱导抗病、抗虫成为近年化学生态学、进化生态学和植物防御抗性研究的热点13，14，15。植物在遭受植食性昆虫为害或其他因素诱导后，能通过生理、生化及形态特征等多方面变化而产生抗虫特性，植物受虫害时还通过产生并释放某些挥发性信息物质来引诱害虫天敌，从而达到间接防御的目的16，20。植物在受到一些生物、化学、物理等因素诱导，会改变病害反应，对病害产生局部的或系统的抗病性1，3，9。然而，诱导作物抗草却是一个空白，至今国内外均未见报道。水稻对杂草的化感作用，并不是存在于每个品种中的，有些品种化感作用比较强，有些品种比较弱甚至没有。植物产生化感作用物质是否和植物产生的抗病、抗虫信息物质一样具有可诱导性，是一个具有重要科学意义的课题，目前未见任何研究报道。能否通过外源物质的施加，使得原来化感作用比较弱甚至没有化感作用的水稻品种产生化感作用？使原来没有化感作用较强的化感品种产生更强的化感作用？ 茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate, MeJA）和水杨酸甲酯( Methyl salicylate，MeSA)在植物界普遍存在，具有广泛的生理功能18 ，是重要的植物生长调节剂，更重要的是，它是病原物、害虫、激发子、胁迫、创伤诱导植物防御基因表达的信号分子，并且本身也可作为激发子3，19。茉莉酸类物质的生理、生态学功能引起了科学界的广泛兴趣，成为研究植物生理学、分子生物学研究的有力工具，其诱导的植物抗病、抗虫性近十年来一直是研究热点17，18，19。茉莉酸是否可以诱导植物产生化感作用从而控制临近杂草的生长呢？大量的研究表明，水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯能诱导植物产生抗虫性和抗病性。外源的水杨酸甲酯可诱导多种植物表达过敏反应（Hypersensitive，HR），合成植保素，产生活性氧，并产生对真菌、细菌、病毒等多种病原的抗性7。许多的试验表明，水杨酸甲酯是植物系统获得性抗性（Systematic acquired resistance，SAR）所必需的6，20。茉莉酸甲酯是从素馨花（Jasminum gradiflorum）)香精油中分离出来的一种易挥发性的化合物。许多研究表明，MeJA可作为病原物、激发子及创伤诱导植物防卫基因表达的信号分子。外源MeJA能诱导植物特异基因的表达，产生茉莉酸酯诱导蛋白，启动防御系统，进而诱发植保素 (Phytoalexins) 和木质素（Lignin）等物质的合成，然后再分别通过抗菌作用促使伤害部位木质化，形成结构及化学屏障，从而限制病原菌的扩展。水杨酸甲酯、茉莉酸甲酯诱导植物产生抗病抗虫作用的物质主要是酚酸类、生物碱类、萜烯类、黄酮类化合物2，18，而这些物质均具有化感作用潜力。但产生化感作用的前提是这些具有化感潜力的化学物质必须释放到周围的环境中并累积到足够的浓度才能产生化感作用。本试验的目的在于研究信号物质水杨酸甲酯、茉莉酸甲酯能否诱导水稻产生化感作用影响伴生杂草稗草的生长，以及不同化感潜力的品种对信号物质诱导的响应规律。2 实验材料与方法2.1材料水稻（Oryza sativa L.）品种PI312777（简称A品种）来源于福建农业大学，品种华粳仙1号（简称B品种）来源于华南农业大学。PI312777是国际上公认的具有化感作用水稻品种。稗草(Echinochloa crus-galli L.)种子从华南农业大学实验农场中采集。茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, 缩写为MeJA)和水杨酸甲酯（Methyl salicylate, 缩写为MeSA）均购于美国 Simga 公司。冰醋酸分析纯，甲醇为HPLC色谱纯。2.2方法2.2.1溶液的配制2.2.1.1茉莉酸甲酯的配制准确量取103 l茉莉酸甲酯（MeJA），加少量95的乙醇（1到2滴），用蒸馏水定容至100 ml，此时MeJA的浓度为5103 mol/L量取5103 mol/L MeJA溶液 1 mL稀释到100 mL，即浓度为510-5 mol/L MeJA的溶液。用同样的方法配置浓度5107 mol/L 和5109 mol/L 的MeJA溶液。2.2.1.2水杨酸甲酯的配制 用灭菌双蒸水配1 mol/L的NaoH溶液，513l水杨酸甲酯溶于1 L灭菌双蒸水中，用NaOH调节pH到6.8，定容到1000ml容量瓶中，此时浓度为5103 mol/L。取10ml，定容于1000ml的容量瓶中，所得溶液即为5105mol/L的水杨酸甲酯。2.2.2茎叶浸提物的生测 将水稻种子消毒（用高锰酸钾浸泡23小时，冲洗），催芽后选取发芽一致的种子种于已消毒的沙中，待长到10 cm时移到烧杯中，待长至六叶期时将MeJA, MeSA涂抹于水稻叶面，以透明塑料封口，诱导后，取出冲洗，然后剪碎茎叶。用蒸馏水浸泡48小时（每8克茎叶需水100克）。在50ml垫有滤纸的烧杯中，每烧杯放入7颗已发芽的稗草种子，并加入2ml生测液。加水，用塑料封口，于恒温（25C）光照培养室中培养7d后，测量稗草根长和苗高。2.2.3根系分泌物的生测将水稻种子消毒 ，催芽，选取发芽一致的种子，植于灭菌沙中，一段时间后移至500ml烧杯中进行水培，培养至六叶期，然后冲洗（先以自来水冲洗根部三次，再以蒸馏水冲洗三次，最后用双蒸水冲洗三次），用滤纸吸干根部水分，再移至50ml的装有灭菌沙的烧杯中，分别涂抹MeJA和MeSA，2d后进行生物测定。2.2.4琼酯培养加浓度为1%的琼酯300 ml于1000 ml的烧杯中，用纱布将烧杯隔开为两部分。一侧种以催芽的B品种种子17棵，另一侧种已催芽的稗草种子14棵。置于恒温（25C）光照培养室中进行培养。分别在水稻2，4，6叶期，在叶面涂抹MeJA和MeSA，7d后将稗草小心取出，而后测根长和苗高。2.2.5 高效液相色谱分析高效液相色谱仪为安洁伦HP1100,反相C18色谱柱(2504.0 i.d., 5)。二极管阵列检测器，检测波长=280nm。柱温为室温，进样量为20 l，流动相组分为甲醇和水(2：8，流动相中蒸馏水用分析纯的冰醋酸调节pH至2.60)。流速为1.0 ml/min。2.3实验统计 利用SAS，EXCEL等软件进行数据统计，用邓肯氏新复极差法（DMRT法）测验不同处理的差异显著性。3 结果与分析3.1 对无化感作用品种的诱导 利用茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯诱导无化感作用的品种华粳籼1号，1d后采集水稻茎叶进行浸提，提取物处理稗草。结果表明，在不同的信号物质处理下B水稻茎的浸提物除MeSA2无明显作用外，其他对稗草的根长,有明显的抑制作用，,而对苗高, MeJA1，MeSA2有极显著的促进作用，MeJA2、MeSA1无明显作用。叶的浸提物对稗草的根长，MeSA1、MeSA2没有影响，MeJA1、 MeJA2有极显著的促进作用，对苗高全都没有明显作用。总的来说，经茉莉酸甲酯和水杨酸甲酯能诱导水稻B品种的茎叶浸提物，能影响稗草的生长，但受多种因素影响，如环境、药品等。另外对稗草影响的部位主要集中在根部，有63的根长受到极显著的影响，而苗高只有25受到极显著的影响。表1 水稻B品种用信号物质诱导1 d后茎叶的水浸提物对稗草幼苗生长的影响浸提物来源部位信号物质浓度（mol/L）稗草根长X S.E. (cm)差异显著性稗草苗高X S.E. (cm)差异显著性茎对照（蒸馏水）05.8641.452A4.4300.787B茉莉酸