酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来 再与杂质分开 而获得所要求的酶制品的过程 主要包括细胞破碎 提取 离心分离 过滤与膜分离 沉淀分离 层析分析 电泳分离 萃取分离 浓缩 干燥 结晶等 第四章酶的提取与分离纯化 酶的提取 分离纯化技术路线 第一节细胞破碎 细胞破碎是通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程 细胞结构 细胞破碎方法及其原理 1 捣碎法利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法 如 动物内脏 植物叶芽 细菌的细胞破碎 2 研磨法利用研钵 石磨 细菌磨 球磨等研磨器产生的剪切力将组织细胞破碎的方法 是实验室内常用的方法 可以加入小玻璃球 玻璃粉 石英砂或氧化铝作助磨剂 常用于微生物和植物组织细胞破碎 3 匀浆法利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎的方法 通常用于破碎易于分散 比较柔软 颗粒细小的组织细胞 一 机械粉碎法 1 温度差破碎法利用温度的突然变化 热胀冷缩的作用使细胞破碎的方法 如将零下18 冷冻的细胞突然放入高温热水中或将较高温度的热细胞突然冷冻 常用于哪些较为脆弱 易于破碎的细胞 如G 注意操作温度不能过高 以免引起酶的失活 2 压力差破碎法通过压力的突然变化使细胞破碎的方法 常用的有高压冲击法 突然降压法和渗透压变化法 高压冲击法在结实的圆柱体容器内装上菌体与助磨剂 用活塞或冲击锤加压冲击 以破碎细胞 爆破性减压法将菌体悬浮在N2 CO2高压下平衡 37 振荡数分钟 然后突然减压 使细胞壁 膜破碎 二 物理破碎法 渗透压变化法是利用渗透压的变化使细胞破碎 将对数生长期的细胞悬浮在高渗透压溶液中 20 蔗糖溶液 平衡一段时间 然后离心收集细胞 将其迅速投入4 左右的蒸馏水或其他低渗溶液中 由于细胞内外的渗透压差别而使细胞破碎 适合膜结合蛋白 细胞间质酶等的提取 对革兰氏阳性菌不适用 肽多糖 3 超声波破碎法利用超声波发生器所产生的声波或超声波的作用 通过液体时形成局部减压 叫空化作用 旋涡生成与消失时 产生很大压力 从而使细胞破碎 超声波破碎具有简便 快捷 效果好等特点 特别适合微生物细胞的破碎 三 化学破碎法 通过各种化学试剂对细胞膜的作用 而使细胞破碎的方法 常用有机试剂有甲苯 丙酮 丁醇和氯仿等 表面活性剂 特里顿和吐温 有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏 从而改变细胞膜的通透性 但应当在低温下操作以防酶变性失活 表面活性剂可以和细胞膜的磷脂以及脂蛋白相互作用 使细胞膜的结构破坏 改变细胞膜通过性 四 酶促破碎法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用 使细胞外层结构受到破坏 而达到细胞破碎的方法 自溶法 将细胞在一定的pH和温度条件下保温一段时间 利用细胞本身酶系的作用 使细胞破坏而使细胞内物质释放出来的方法 溶菌酶处理用溶菌酶专一性地分解菌体细胞壁上肽多糖分子的 1 4 糖苷键 从而破坏细胞壁 酵母细胞 葡聚糖酶霉菌 几丁质酶 超声波细胞粉碎机 电动玻璃匀浆机 高压细胞粉碎机 细胞破碎珠 第二节酶的提取 酶的提取是指在一定的条件下 用适当的溶剂或溶液处理含酶原料 使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程 也称为酶的抽提 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质 选择适当的溶剂 一般说来 极性物质易溶于极性溶剂中 非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中 酸性物质易溶于碱性溶剂中 碱性物质易溶于酸性溶剂中 酶都能溶解于水 通常可用水或稀酸 稀碱 稀盐溶液等进行提取 有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团 则可用有机溶剂提取 一酶的主要提取方法 1 温度温度通常控制在0 4 左右 如果酶比较稳定时 可以例外 如胃蛋白酶可在37 保温抽提 2 pH选用pH 首先考虑酶的稳定性 选用pH不应超过酶的pH稳定范围 其次 从抽提效果出发 最好远离待抽提酶的等电点 也就是说 酸性蛋白宜用碱性溶液抽提 碱性蛋白宜用酸性溶液抽提 3 抽提液用量抽提液用量常采用原料量的3 5倍 有时 为了抽提效果好些需要反复抽提时 抽提溶液比例可能大些 二 影响提取的主要因素 第三节沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质 使酶的溶解度降低 而从溶液中沉淀析出 与其它溶质分离的技术过程 盐溶 球蛋白在低浓度盐溶液中 其溶解度随盐离子强度升高而加大的现象 这主要是由于蛋白质分子吸附某种盐离子后 带电表层使蛋白质分子彼此排斥 而与水之间相互作用加强 因而溶解度提高 盐析 当盐浓度继续升高到一定浓度时 蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而降低 结果使蛋白沉淀析出 这种现象称为盐析 盐析作用的理论基础尚不明了 大致是由于高盐离子使水的相对浓度降低 蛋白质失去水化作用 引起分子之间疏水部分吸引力增加 以致沉淀析出 一 盐析沉淀法 式中 S为酶或蛋白质在离子强度为I时的溶解度 g L S0为酶或蛋白质在离子强度为0时的溶解度 g L Ks为盐析系数 I为离子强度 温度和pH一定时 S0为一常数 在一定的温度和pH值条件下 为常数 通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析 而在一定的盐和离子强度的条件下 KsI为常数 通过改变温度和pH值 使不同的酶或蛋白质分离的方法 称为 分段盐析 在蛋白质的盐析中 通常采用的中性盐有硫酸铵 硫酸钠 钾 镁 氯化钠和磷酸钠等 其中以硫酸铵最为常用 这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小 不影响酶的活性 分离效果好 而且价廉易得 各种酶所需硫酸铵的沉淀浓度是不同的 所以可用分级沉淀法将各种酶分级沉淀 硫酸铵盐析时溶液的盐浓度以饱和度表示 饱和盐溶液的饱和度为100 在0 约为4mol 调整盐浓度有两种方法 当蛋白质溶液体积不大 要达到的盐浓度不高 可加入饱和硫酸铵溶液 100m1硫酸铵溶液 由饱和度S1变为S2 应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数 V 为 V Vo S2 S1 1 S2 当蛋白质原有体积较大 要达到的盐浓度又较高 此时加入固体硫酸铵为宜 在0 25 下 硫酸铵浓度由饱和度Sl增至S2 应向1L溶液中添加的固体硫酸铵的克数 可以直接查表 盐析的优点 不会引起蛋白质变性 经透析去盐后 能得到保持生物活性的纯化蛋白质 注意事项 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度 溶液pH值越接近蛋白的等电点 蛋白质越容易沉淀 盐析一般用的硫酸铵 容易吸潮 因而在使用前 一般先磨碎 平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量 这样更准确 在加入盐时应该缓慢均匀 搅拌也要缓慢 越到后来速度应该更注意缓慢 如果出现一些未溶解的盐 应该等其完全溶解后再加盐 以免引起局部的盐浓度过高 导致酶失活 盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理 以免变性 透析较慢 一般可用超滤或者G 25 G 50处理 蛋白质是两性电解质 所带电荷则因pH变化而变化 当蛋白质处于等电点 pI pH时 蛋白质的静电荷为零 相同蛋白质分子间没有了静电排斥作用而趋于聚结沉淀 溶解度达到最低点 不同蛋白质具有不同的pI值 利用蛋白质在pI时溶解度最低的原理 可以把不同的蛋白质分开 二 等电点沉淀法 在酶溶液中加入与水互溶的有机溶剂 可降低溶液的介电常数使酶分子间的静电引力增强而发生沉淀 另外 有机溶剂也可能使酶蛋白脱水而发生沉淀 三 有机溶剂沉淀法 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇 丙酮 异丙醇 甲醇等 有机溶剂的浓度以百分体积 m1 比表示 加入量依下式计算V Vo S2 S1 S S2 式中 V为应加入的有机溶剂体积 Vo为原有的体积 S S1 S2分别为待加的 原溶液中含有的及所达到的有机溶剂百分比浓度 世界酶学史上第一个酶蛋白结晶便是Sumner在刀豆脲酶抽提液中加入32 丙酮得到的脲酶结品 温度因为大多数球蛋白在有机溶剂中不稳定 特别是在温度较高时 更易变性失活 因此 所有操作必须在0 以下进行 有机溶剂必须冷却至 15 20 然后搅拌下缓慢加入 沉淀析出后赶快离心分离 并用预冷缓冲液溶解所得沉淀 以降低有机溶剂浓度 pH一般在进行有机溶剂法时 溶液pH尽可能靠近待纯化酶的pI值 此法分辨率较高 溶剂易除去 但易引起酶的变性失活 影响有机溶剂沉淀法的因素 大分子量的非离子型聚合物 如聚乙二醇 PEG 聚乙烯亚胺 PEI 单宁酸 硫酸链霉素以及离子型表面活性剂 SDS等 用来沉淀蛋白质的方法 它们在一定条件下能与蛋白质直接或间接形成络合物 使蛋白质析出 离心后收集沉淀 再用适当的方法使酶溶解出来 如 PEG常用到的分子量为6000和4000的20 W V 的浓度能将许多蛋白质沉淀出来 四 复合沉淀法 五 选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀 而不影响所需的酶的分离方法 如对于热稳定性好的酶如 淀粉酶 可以通过加热处理 使大多数杂蛋白变形沉淀而被除去 第四节离心分离 一 离心原理 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力 使不同大小 不同密度的物质分离的技术过程 根据物质颗粒的沉降系数 质量 密度及浮力等特点进行分离 当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时 由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉 粒子越重 下沉越快 反之密度比液体小的粒子就会上浮 微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小 形态和密度有关 并且又与重力场的强度及液体的粘度有关 在离心分离时 要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小 密度和特性的不同 选择适当的离心机 离心方法和离心条件 1 离心力质量为m的粒子以一定的角速度作圆周运动时受到向外的离心力 颗粒沉降速度决定于应用的离心加速度 ac 它决定于转子的角速度 弧度 秒 与半径 厘米 1 由于转子转一圈等于2 弧度 角速度则为 2 式中n为转子每分钟转数 为转子的角速度 弧度 秒 以 2 带入 1 中 离心加速度即为 3 由此可知离心力大小与转速的平方成正比 与半径成正比 在实际工作中半径是以平均迴转半径计算 即由轴心到离心溶液中心的迴转半径计算 通常 低速离心以每分钟的转数表示 如 4000r min 高速离心 超速 常以相对离心力 RCF 表示 如 65000g 离心力一般用相对离心力RCF 即离心力的大小相当于地球引力 重力常数g 的多少倍 一般用RCF g表示 g为重力加速度 980厘米 秒2 2 沉降速度和沉降系数 沉降系数指单位离心力下颗粒的沉降速度 用S表示 用离心法时 大分子沉降速度的量度 等于每单位离心场的速度 或s v 2r s是沉降系数 是离心转子的角速度 弧度 秒 r是到旋转中心的距离 v是沉降速度 沉降系数以每单位重力的沉降时间表示 由于许多生物大分子的S值很小 所以定义10 13s为一个沉降单位 1S 1 10 13s 常用S表示某些生物大分子 亚细胞及亚细胞器的大小 如16sRNA 蛋白质的沉降系数一般在1 200之间 沉降速度是指在离心力作用下 单位时间内物质运动的距离 常速离心机又称为低速离心机 其最大转速在8000r min以内 相对离心力 RCF 在1 104g以下 在酶的分离纯化过程中 主要用于细胞 细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离 也用于酶的结晶等较大颗粒的分离 高速离心机的最大转速为 1 2 5 104r min 相对离心力达到1 104 1 105g 在酶的分离中主要用于沉淀 细胞碎片和细胞器等的分离 为了防止高速离心过程中 温度升高而造成酶的变性失活 有些高速离心机装设有冷冻装置 谓之高速冷冻离心机 超速离心机的最大转速达 2 5 12 104r min 相对离心力可以高达5 105g甚至更高 超速离心主要用于DNA RNA 蛋白质等生物大分子以及细胞器 病毒等的分离纯化 样品纯度的检测 沉降系数和相对分子质量的测定等 二 离心机的选择 低速离心机 高冷冻速离心机 大容量离心机 三 离心方法的选用 1 差速离心是采用不同的离心速度和离心时间 使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法 在选择离心转速时 应先采用低速离心 使最大颗粒沉于管底 去掉沉淀后 再增加离心力 分离出中等大小的颗粒 最后按照最小颗粒选择离心力 使其形成沉淀 对形成的各级沉淀经过重悬浮