专题5 DNA和蛋白质技术 课题1 DNA的粗提取和鉴定 讨论2 如何证明他们是遗传物质 讨论3 怎样才能将细胞内的这些物质分离出来 讨论1 构成生物体的遗传物质是什么 自主学习 实验思路 1 DNA从哪提取 用什么方法破碎细胞而DNA不受破坏 2 怎样将DNA与细胞中的其他生物大分子分离 3 怎样鉴定我们提取的DNA 一 基础知识 一 提取DNA的方法阅读课本54页 思考 提取生物大分子的基本思路是什么 DNA主要与哪些生物大分子分离 方法1 根据DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同 提取DNA结合图 思考回答课本的问题 1 DNA在0 14mol LNaCl溶液中溶解度最低而蛋白质此时的溶解度最高的特点 可以使DNA与蛋白质分离 形成沉淀析出 通过过滤 得到初提取的滤出物DNA 2 利用DNA不溶于酒精 细胞中的某些蛋白质可溶于酒精的特点 可以将DNA与蛋白质进一步分离 3 蛋白酶能水解蛋白质 但是对DNA没有影响4 大多数蛋白质不能忍受60 80 C的高温 而DNA在80 C以上才会变性 蛋白质变性后溶解度降低而产生沉淀 5 洗涤剂能够瓦解细胞膜 脂质 但对DNA没有影响 在植物材料中提取DNA使用 二 检验原理 1 DNA遇二苯胺 沸水浴 呈蓝色2 甲基绿与DNA结合 呈绿色 二 DNA的粗提取与鉴定的实验设计 一 实验材料的选取阅读55页的实验材料 材料 新鲜的鸡血 原则上只要含DNA的生物材料都可以 但是选取DNA含量相对较高的生物组织 成功率更大 鸡血细胞核的DNA含量丰富 材料易得 鸡血细胞极易吸水胀破 而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心 对设备要求较高 操作繁琐 历时较长 二 破碎细胞 获取含DNA的滤液 DNA释放和溶解 此步为实验成功以否的关键1 破碎动物细胞的方法 2 破碎植物细胞的方法 渗透吸水胀破 洗涤剂 食盐搅拌研磨 不充分 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体 水分大量进入血细胞 使血细胞胀裂 加上搅拌作用 加速鸡血细胞细胞膜 核膜破裂 从而释放出DNA 洗涤剂 离子去污剂 能溶解细胞膜 利于DNA释放食盐 NaCl 利于DNA的溶解于研磨液中研磨不充分 使细胞核内的DNA释放不完全 提取的DNA量变少 导致看不到丝状沉淀物 用二苯胺鉴定不显示蓝色等 三 去除滤液中的杂质 DNA的纯化 阅读课本55页的三个方案下面以鸡血为实验材料粗提取DNA并鉴定DNA的实验过程 请观察并总结实验步骤 新鲜的鸡血鸡血细胞 离心 1 获取实验材料 柠檬酸钠溶液 用吸管除去离心管上部的澄清液 2 破碎细胞 获取含DNA的滤液 DNA的释放 鸡血细胞 足量的蒸馏水 玻璃棒一个方向快速充分搅拌 细胞破裂 一层纱布过滤 1 含染色质的滤液 3 去除滤液中的杂质 获取DNA的粗提取物 DNA的纯化 染色质滤液 2mol LNaCl溶液 玻璃棒一个方向搅拌 析出DNA黏稠物 DNA溶解 染色质中的DNA与蛋白质分离 慢加足量蒸馏水 NaCl溶液浓度由2mol L变0 14mol L DNA溶液 多层纱布过滤 2 纱布上DNA的黏稠物 2mol LNaCl溶液 二层纱布过滤 含DNA的NaCl滤液 含DNA的NaCl滤液 冷却的无水乙醇 玻棒轻搅 乳白色DNA细丝 3 去除滤液中的杂质 获取DNA的粗提取物 DNA的纯化 去除滤液中的杂质小结 方案一 染色质滤液 2mol LNaCl溶液 玻璃棒一个方向搅拌 DNA溶解 染色质中的DNA与蛋白质分离 多层纱布过滤 纱布上DNA的黏稠物 DNA溶液 析出DNA黏稠物 慢加足量蒸馏水 NaCl溶液浓度由 变 玻璃棒一个方向轻搅拌 DNA析出白色丝状黏稠物 蛋白质溶解 滤取DNA黏稠物 DNA黏稠物再溶解 2mol LNaCl溶液 过滤含DNA的NaCl滤液 DNA溶解 蛋白质沉淀 二层纱布过滤 提取含杂质较少的DNA细丝 含DNA的NaCl滤液 冷却的无水乙醇 玻棒轻搅 乳白色DNA细丝 方案二 直接在滤液中加入嫰肉粉 图5 3 反应10 15min 嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质方案三 将滤液放在60 75 的恒温水浴箱中保温10 15min 注意严格控制温度范围讨论 方案二与方案三的原理有什么不同 答 方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白 从而使提取的DNA与蛋白质分开 方案二利用了酶的专一性 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同 从而使蛋白质变性 与DNA分离 方案三利用了DNA的稳定性 4 DNA的鉴定 DNA细丝 2mol LNaCl 含DNA的NaCl溶液 4ml二苯胺 实验组 水浴加热 蓝色 等量2mol LNaCl 4ml二苯胺 水浴加热 对照组 无蓝色 答 整个实验共 两次蒸馏水 三次过滤 两次析出 六次搅拌 讨论 两次蒸馏水 第一次 细胞吸水胀破第二次 使DNA黏稠物析出第三步 1 此实验过程中有几次使用蒸馏水 几次过滤 几次析出 几次搅拌 分别在哪一步 过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关 第二次要用其滤出的黏稠物有关 所以要使用多层纱布 第一次和第三次均要用其滤液 使用的纱布为1 2层 三次过滤 第一次 DNA存在于滤液里第一步第二次 DNA被留在纱布上第四步第三次 DNA存在于滤液里第六步 两次析出 第一次 用0 14mol L的NaCI溶液含杂质多 第三步 第二次 用冷却的95 的酒精 第七步 六次搅拌 第一 二 三 五 七步 其中除第八步外 其余均要朝一个方向搅拌 在第三 五步搅动还要轻缓 玻璃棒不要直插烧杯底部 这样才能保证得到完整的DNA 1 在制备鸡血细胞液的过程中 加入柠檬酸钠的目的是 A 防止凝血B 加快DNA析出C 加快DNA溶解D 加速凝血 练一练 2 DNA的溶解度最低时 NaCl的物质的量浓度为 A 2mol lB 0 1mol lC 0 14mol lD 0 015mol l3 在向溶解DNA的NaCl溶液中 不断加入蒸馏水的目的是 A 加快DNA溶解的速度B 加快溶解杂质的速度C 减小DNA的溶解度 加快DNA析出D 减小杂质的溶解度 加快杂质的析出 4 向溶有DNA的2mol L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水 在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是A减小 减小B增大 增大C先减小后增大D增大 减小5 欲使溶有DNA的2mol L的NaCl溶液中的DNA析出 最有效的办法是A加蒸馏水B加矿泉水C加清水D加生理盐水 6 与析出DNA粘稠物有关的叙述 不正确的是A操作时缓慢滴加蒸馏水 降低DNA的溶解度B操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整C加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度D当丝状粘稠物不再增加时 NaCl溶液的浓度可以认为是0 14mol L 7 你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗 用甲基绿染液 结果丝状呈现绿色 8 DNA遇二苯胺会染成 沸水浴 A硅红色B红色C紫色D蓝色 二 案例二 以菜花为实验材料进行DNA的粗提取 1 课前准备 将新鲜菜花和体积分数为95 的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h 2 提取DNA的具体步骤 取材 称取30g菜花 去梗取花 切碎 研磨 将碎菜花放入研钵中 倒入10mL研磨液 充分研磨10min 过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布 将菜花研磨液过滤到烧杯中 有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心 用1000r min的转速 离心2 5min 取上清液放入烧杯中 在4 冰箱中放置几分钟后 再取上清液 沉淀 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95 的预冷乙醇溶液中 并用玻璃棒缓缓 轻轻地搅拌溶液 玻璃棒不要直插到烧杯底部 沉淀3 5min后 可见白色的DNA絮状物出现 用玻璃棒缓缓旋转 将絮状物缠绕在玻璃棒上