D 二聚体的检测与应用 威士达医疗有限公司 单卫民 2012 06 20 内容提要 一 D 二聚体的产生及技术现状二 D 二聚体检测试剂的要求三 标准化问题四 InnovanceD Dimer试剂五 D 二聚体检测的临床应用六 D 二聚体检测结果的解释 2 D Dimer检测技术的发展史 1972年 Gaffney首先提出D Dimer检测 可作为监测凝血性疾病的 有用的工具 1983年 Rylatt等首先报道了用单克隆抗体 DD 3B6 22 检测D Dimer 乳胶凝集法 当时被誉为 金标准 90年代 ELISA分析法 乳胶增强型免疫分析法等 90年代末到本世纪初 免疫比浊法在凝血仪上实现了自动化检测 但D 二聚体片段异源性的问题被忽略了 3 凝血系统 内源性凝血 外源性凝血 凝血酶原 凝血酶 FXIII FXIIIa 纤溶酶原 纤溶酶 纤维蛋白单体 纤维蛋白原 交联纤维蛋白 FDPX Y D E等碎片X 等碎片DD DXD DD E YXD等复合物 一 D 二聚体的产生 纤溶系统 纤溶 凝固 4 5 所检测的D二聚体片段 D 二聚体检测的技术现状 制备单克隆抗体 针对的只是某类型D 二聚体 病理过程中可产生多种类型D 二聚体 由于不同检测试剂只测定其中某种类型 而非降解片段的全部 因此各类试剂在对同一标本进行测定时 其敏感性显著不同 目前 30种检测方法 20余种单克隆抗体 被应用于临床 不同试剂间差异非常显著 无统一的国际标准 6 D 二聚体检验方法的演变 低敏方法导致许多病理状态无法及时反映 急性肺血栓栓塞症诊断治疗专家共识 中华内科杂志2010年1月 推荐 高敏感度的方法 国际上目前已经开始逐渐推动高敏方法 原方法敏感度低 阳性率低 新方法敏感度高 阳性率高 临床 与既往的使用经验不符 7 8 二 D 二聚体检测试剂选择 高度敏感性和NPV 几乎 无假阴性 有明确的阈值 cutoff值 适用于24小时作常规分析可用于门急诊标本分析自动化检测操作步骤简易快速的报告时间定量检测 有标准 质控物经济 9 检测试剂盒 目前市场上用于检测D 二聚体的试剂品种有很多种 大体上可分为两种情况 一种是以欧美产品为代表 主要用于DVT PE排除筛查特点 灵敏度高 检测范围相对较窄 另一种是以日本产品为代表 主要是用于DIC诊断特点 灵敏度相对较低 检测范围较宽 10 VTE DVT PE exclusion DIC D Dimer 无统一的国际标准目前有超过30种检测方法和20多种单抗被使用 存在两种报告单位 D dimer DDU 和纤维蛋白原当量 FEU 抗体对D二聚体不同片段有不同的亲和力不同的试剂有不同的干扰情况 11 三 标准化问题 12 美国临床实验室标准化协会 CLSI H59 P推荐指南 13 D二聚体试剂标准 中国国家标准 讨论稿 4 2阴性预测值结合临床诊断的验前概率进行D 二聚体检测 其阴性预测值应不低于95 4 3测试范围涵盖制造商提供的用于排除诊断的临界值的1 2到4倍的临床标本测定值 4 4线性D 二聚体试剂在测试范围内 线性相关系数应大于0 98 4 5精密度4 5 1重复性用正常质控血浆同日内重复测试所得结果的变异系数 CV 不超过15 用高值异常质控血浆同日内重复测试所得结果的变异系数 CV 不超过10 14 4 7报告方式D 二聚体的报告单位通常包括纤维蛋白原等量单位 FEU 和D 二聚体单位 DDU 两种形式 FEU是将D 二聚体的量用降解前纤维蛋白原分子的量来表达 因此 用FEU表达的D 二聚体的量相当于用DDU表达的1 7倍 在D 二聚体报告方式中还包括ng mL ug mL和mg L等形式 通常应该直接采用制造商提供的单位 不建议进行形式和量纲的转换 15 四 InnovanceD Dimer检测试剂 已通过美国FDA验证 FDA510K 明确可用于静脉栓塞性疾病的排除 其阈值为0 5mg LFEU已得到EHA ICTH和日本病理学会接受 2010年在中国成功注册 16 17 检测原理 全自动乳胶增强免疫比浊度法新一代单克隆抗体8D3 检测系统 Sysmex CA 7000systemSysmex CA 1500systemSysmex CA 560systemCSseries 18 检测试剂 抗体试剂 REAGENT乳胶颗粒包被低压冻干 需蒸馏水复溶稀释液 DILUENT液体 用于样本稀释 定标稀释有缓冲液作用添加剂 SUPPLEMENT液体 用于封闭非特异性抗体缓冲液 BUFFER液体 使信号增强含有聚合碳水化合物的缓冲液 19 定标品 与试剂批号匹配有不同系统的靶值冻干粉人血浆为基质 所含D二聚体浓度大约为4 4mg LFEU定标曲线有效期6个月以上 20 定标范围 0 19 4 40mg LFEU或更宽自动6点定标定标有效期达6个月以上样本每测试 8 15 L 单次检测检测范围0 19 35 20mg LFEU样本结果高于定标曲线范围 仪器自动稀释样本高于检测范围 可用Innovance D DIMERDiluent再进行检测 21 质控品 CONTROL1冻干粉正常范围 大约0 3mg LFEU 低于参考范围和CUTOFF值CONTROL2冻干粉异常范围 大约3mg LFEU 高于参考范围和CUTOFF值 22 试剂稳定性 分析性能 23 抗原过剩D dimer在500mg LFEU以下 和FDP在2000mg LFEU以下都没有抗原过剩是cutoff值0 5mg LFEU的1000倍 分析灵敏度 24 对潜在干扰物质不敏感 主要通过SUPPLEMENT来阻断非特异性抗体 抗干扰能力 25 Innovance D DIMER的参考区间及cutoff值 正常人群的百分之90分位数 0 55mg LFEUCutoff值 0 5mg LFEU没有检测系统差异略高于CUTOFF值85 的正常人群的D二聚体低于0 50mg LFEU均值和中位数均低于CUTOFF值 26 27 1 在不同地区建立样本采集点 2 收集门诊怀疑有DVT和PE的病人样本 至少300人 3 病人选择 采用Wells的验前概率 PretestProbabilityPTP 评估规则和影像学检查 并对阴性病人进行为期三个月的随访 以最终确诊是否患有DVT或PE 4 剔除预防或抗凝治疗的病人和孕妇 5 对所有选中的疑似患者同时进行D 二聚体检测和影像学检查 6 对D 二聚体检测结果作受试者工作特征 ROC 曲线并确定cutoff值 国外通常采用以下步骤建立cutoff值 FDA验证结果 FDA510K 28 LCL Lower95 confidencelimit 29 结果报告 结果报告的形式和单位按厂家推荐 不要对单位做任何转换不是所有的D 二聚体检测的阈值 cutoff值 都是500ug LFEU或0 5mg LFEU报参考区间还是报cutoff值 30 InnovanceD Dimer与D DimerPlus的比较 31 为什么要更换 给临床一个解释 1 高灵敏度检测D 二聚体 是检测本身的要求 也是临床评估和诊断疾病的要求2 InnovanceDD通过FDA认证 并明确用于DVT和PE排除已得到EHA ICTH和日本病理学会接受3 选用新的单抗8D3 其灵敏度 稳定性 抗干扰能力更优4 Cutoff值的设定更科学合理 符合行业内认可 标准 5 结果报告单位 使用mg LFEU 符合目前国际趋势6 线性范围更宽 便于临床动态观察 32 五 D 二聚体检测的临床应用 深静脉血栓 肺栓塞 早期排除诊断 DIC的早期诊断和动态监测 外科手术后的血栓监测 妊高症 先兆子痫的监测 恶性肿瘤 白血病早期识别 血栓监测 肝脏疾病 重症肝炎 肝硬化 肾脏疾病 肾病综合征 肾移植术后 溶栓治疗评估及血栓复发的监测 心血管疾病病情评估 心力衰竭 房颤 旁路手术 脑梗死鉴别和治疗监测 33 1 DVT和PE的排除 D 二聚体检测最大的临床价值是用于排除DVT和PE 循证医学证实其VTE和PE的排除性诊断价值 目前临床结合验前概率 pretestprobability PTP 同时检测患者D 二聚体浓度 来排除DVT和PE 当PTP评估为低 中风险 D 二聚体检测cutoff值为阴性 0 5mg LFEU 即可排除DVT和PE 无需再做进一步的影像学检查 34 血管造影虽是诊断DVT和PE的 金标准 但其检查费用相对较高 且有侵入性损伤 同时还受到医院医疗水平的制约 肺部扫描和超声也可选择 但也不便作为常规筛查 D 二聚体测定简单便捷 价格低廉 特别适合对门诊病人的常规筛查 国外研究表明 D 二聚体检测结合PTP可使30 35 怀疑有DVT PE的病人免受进一步检查 从而减少不必要的痛苦和费用 35 深静脉血栓 DVT 验前概率评估规则 变量评分 活动性癌症 治疗至少6个月或缓解1 瘫痪 麻痹或下肢石膏固定1 最近卧床3天以上或大手术4个星期内1 沿深静脉分布局部压痛1 整个腿水肿1 单侧小腿肿胀大于3cm1 单侧有凹陷性水肿1 仅在腿部浅静脉处有症状1 有DVT既往病史1 比DVT更有可能诊断为其他疾病 2 DVT不太可能 1 DVT可能 2 36 肺栓塞 PE 验前概率评估规则 变量得分 有DVT的症状和体征 肿胀和疼痛 3 PE诊断的可能性大于其他疾病的诊断3 制动 如卧床大于3天 或4周前手术1 5 有DVT或PE的既往病史1 5 心率大于100次 分钟1 5 咯血1 活动性癌症 治疗至少6个月或缓解 1 低风险 6分 37 2 弥漫性血管内凝血 DIC 的诊断 作为继发性纤溶亢进的标志性物质 D 二聚体在DIC的诊断和病程监测上具有良好的应用价值 在DIC形成早期即有D 二聚体升高 而且随病程的发展 D 二聚体可持续升高达10倍以上 因此 D 二聚体可作为DIC早期诊断和病程监测的主要指标 D 二聚体与FDP同时测定 可大大提高其诊断效率 DIC实验室指标的选择和应用 同时有三项以上异常 血小板计数 4 0g L 或进行性下降D 二聚体 FDP 进行性增高凝血酶原时间 PT 缩短或较正常对照延长3sec以上 肝病超过5sec纤溶酶原 PLG 含量 活性降低抗凝血酶 AT 含量 活性降低 肝病不适用 F 活性 50 肝病必备 38 39 诊断DIC中应用 鉴别原发性纤溶和继发性纤溶 DIC 前者FDPs D D N 后者FDPs和D D都 40 41 3 溶栓治疗的监测 在溶栓治疗中 D 二聚体含量变化一般有以下特点 溶栓后D 二聚体含量在短期内明显上升 而后逐渐下降 提示治疗有效 溶栓后D 二聚体含量持续升高或下降缓慢 提示溶栓药物用量不足 溶栓治疗应持续到D 二聚体含量下降至正常范围 恢复正常的D 二聚体是停止溶栓的指征 42 不同疾病的溶栓治疗 D 二聚体峰值变化的时间有所不同 在急性心梗 脑梗溶栓后1 6hD 二聚体达到峰值 24h降至溶栓治疗前水平 在DVT溶栓治疗时 D 二聚体峰值常出现在24h或以后 慢性期DVT患者 溶栓前D 二聚体含量高于正常 而溶栓后D 二聚体含量不升高 或迅速下降至正常范围 说明此时仅有少量新鲜血栓形成 大部分为机化的陈旧血栓 溶栓常不能收到满意效果 4 孕妇的D二聚体水平 孕妇处于高凝状态 常规的DVT PE排除的cutoff值并不适用于孕妇 如图显示 正常孕妇随着孕期的增长 D二聚体水平逐渐升高 直至产后D二聚体才开始下降 该文章建议 应建立适合孕妇的DVT PE的排除诊断的cutoff值 Thediagnosticmanagementofacutevenousthromboembolismduringpregnancy recentadvancementsandunresolvedissues M Tan M V Huisman文中建议INNOVANCED Dimer对于孕妇的排除诊断DVT的cutoff值为1 5mg LFEU 43 妊娠20周D 二聚体与FDP的变化