分子医学技能实验 袁洁yuanjie 实验一口腔粘膜细胞基因组DNA制备2010 9 19 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库 Southern杂交 包括RFLP 及PCR分离基因等 是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤 一 基因组DNA的提取与纯化 目的 核酸分离纯化的总原则 保证核酸一级结构完整 排除其它分子的污染 细胞内 蛋白质 脂类 糖 RNA等提取过程中 有机熔剂 金属离子 外源DNA 细胞样品的核酸提取的主要步骤 破碎细胞去除细胞内的其它分子 蛋白质多糖脂类去除盐类 有机溶剂等杂质 核酸提取注意事项 减少化学因素对核酸的降解如过量酸碱减少物理因素对核酸的降解机械剪切力 强烈震荡 渗透压急剧改变 反复冻融高温防止核酸的生物降解核酸酶的预防 二 人基因组DNA的制备 实验目的及意义 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA掌握基因组DNA抽提的方法 理解核酸分离纯化的基本原理 分离纯化基因组DNA的常用方法 不同生物 植物 动物 微生物 的基因组DNA的提取方法有所不同 分离方法也有差异 主要根据不同细胞的特点而有区别 但原理相似 因此它们有共同的步骤 裂解细胞 SDS裂解细胞 EDTA抑制核酸酶除去蛋白质 蛋白酶K水解蛋白质 酚和氯仿 异戊醇抽提 分离蛋白质 析出DNA 乙醇沉淀使DNA从溶液中析出 实验材料及试剂 材料 人口腔上皮细胞试剂 抽提缓冲液 Tris ClpH8 0 EDTA NaCl RNAase SDS 蛋白酶K水饱和酚氯仿 异戊醇 V V 24 1 75 乙醇 95 乙醇TE缓冲液 Tris EDTA 主要试剂的功能 抽提缓冲液 由SDS EDTA 蛋白酶K组成SDS的作用是裂解细胞EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子 防止DNA酶对DNA分子的降解作用 蛋白酶K的作用是水解蛋白质 酚和氯仿 异戊醇 抽提分离蛋白质乙醇 沉淀DNATE 溶解DNA 2020 5 7 10 可编辑 取材 用生理盐水漱口后 口含生理盐水10 15ml约2 3min 用15ml离心管 4000rpm 10min 收集细胞沉淀 离心机的使用 平衡 加入0 5ml抽提缓冲液 重悬沉淀 转移至1 5mlEP管 微量移液器的正确使用 混匀 65 温育30min加入等体积的饱和酚 0 5ml 充分颠倒混匀 不要震荡 P13 实验步骤及注意事项 一人一组 12000rpm 5min 上层水相转移至新的EP管 高速离心机的使用与安全意识 加入等体积氯仿 异戊醇 颠倒混匀12000rpm 5min 上层水相转移到新的EP管 加入2倍体积95 的乙醇 颠倒混匀12000rpm 10min 弃上清 沉淀中加入75 乙醇12000rpm 2min 轻轻弃去上清 打开EP盖 室温静置5 10min加入30 l0 1 TE溶液 充分混匀后检测结果 分子医学实验注意事项 微量移液器的正确使用离心机的正确使用上课纪律撰写实验报告的规范 实验结果及其分析 定性分析 DNA琼脂糖凝胶电泳 PCR SSCP多态性分析 下次实验课进行 常见问题 1 提取的DNA不纯 变性不充分 关键过程反应时间过短 离心时间或速度不够 2 提取的DNA成涂布状 操作过程中用力过猛 动作粗暴 操作系统有污染 3 与细胞器DNA分离不全 变性过程不完全 试剂配置问题 ThankYou 2020 5 7 19 可编辑