发光的大肠杆菌 朱静宇张明石卉 制备感受态细胞 质粒扩增 质粒酶切 目的基因序列扩增 连接 转化 实验方案概述 材料 大肠杆菌少量PET28质粒 既为原核质粒又为真核质粒 显示绿色荧光的PEGFP N3质粒 为真核质粒 制备大肠杆菌感受态细胞 挑取E coil单菌落接种至2mlSOC培养液 37 摇床过夜 挑取0 5 1ml过夜培养的菌液转种到50mlSOB中 18 剧烈震荡 直至A600达到0 6 取出水浴10min4 4000rpm min10min 同时冰浴配置TB溶液 弃上清 倒置离心管于滤纸上1mlTB溶液打散菌体沉淀 再加入15mlTB溶液冰浴10 15min 4 4000rpm min10min去上清 沉淀重悬于4mlTB中 冰浴10min加入280uLDMSO 混合均匀 冰浴10min分装于EP管中 80 或液氮保存检测感受态细胞的质量 阴性对照 质粒扩增 pet28的质粒扩增 PEGFP N3质粒扩增 摇菌 转化 提质粒 转化 取100ul感受态细胞于冰浴上融化加入1ulpet28质粒和1ulPEGFP N3质粒 轻轻吹匀 冰浴30min将菌液放入42 C水浴热激90s 立即放入冰浴中2min将菌液2000rmp min离心3min 留200ul上清液将菌体打散 均匀涂布于含卡那抗性的琼脂平板 平板于37 C倒置培养过夜 同时进行阳性和阴性对照 摇菌 提质粒 将培养过夜的平板取出 用已灭菌的枪尖挑取平板上单个的较大的菌落将移液枪尖打入5ml培养基内 放入37 C摇床中rpm min 摇菌16小时左右运用Omega等品牌的试剂盒对菌液进行小提用浓度为1 的胶 120V20min 用10000的marker做对照验证测浓度 质粒的酶切 寻找pet28和pegfp n3的酶切位点 质粒的酶切 两个质粒同时酶切 确定的酶切位点 EcorRI XbaI 内切酶 NotI BamHI内切酶Buffer cutsmart 37 温育4hours 未酶切的质粒作对照 1 琼脂糖凝胶电泳鉴定结果 纯化 01 02 03 04 05 06 设计引物 PEGFP N3目的基因扩增 PCR 电泳 胶回收 纯化 测序 PEGFP N3目的基因EGF的PCR引物 PEGFPN5 5 TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG3 PEGFPN3 5 GTCGCCGTCCAGCTCGACCA3 Primer2Tm68 5 CMolecularweight6863 5g molExtinctioncoeficient181100 0l mol cm Primer 1Tm57 6 CMolecularweight6863 5g molExtinctioncoeficient229700 0l mol cm SXJ PCR体系 premix体系 TakaRaTaqdNTPmixturePCRbuffer PCR反应条件 循环35次 02 01 03 加入样品与buffer 混匀 短暂离心 孵育22 3h 连接 01 02 03 04 05 质粒的转化 感受态细胞冰浴融化 加入质粒 混匀 冰浴 菌液热激90s后冰浴2min 加SOD 37 摇菌 2000rpm min3min涂布 涂布后 适当培养 挑取单克隆大肠杆菌菌落 进行检验 挑菌落 镜检 在荧光显微镜下可看见发绿色荧光的大肠杆菌即为实验成功