荧光PCR体系的优化及多色荧光PCR 程扬健 厦门大学生命科学院分子诊断实验室 什么是Ct值和 Rn Ct值中的C代表循环数 Cycle t代表域值 threshold Ct值的含义是 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 Rn 相对荧光强度 为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量 实时荧光PCR是如何定量 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 其中横坐标代表起始拷贝数的对数 纵坐标代表Ct值 如图所示 因此 只要获得未知样品的Ct值 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 在一定范围 Ct值 PCR检测过程 RealtimePCR 实时荧光定量PCR优化目标 3 R值 优化内容 引物设计和筛选探针设计和筛选反应体系的优化反应程序的优化 HCV 分子信标 引物的设计与筛选1 序列查找与比对 附 主要数据库的网址 二级结构分析 条件 42 50mMNa 2 5mMMg2 http www bioinfo rpi edu zukerm rna 引物的设计与筛选2 HCV5 UTR 引物筛选结果 引物的设计与筛选4 引物用量的优化 不对称PCR S A 1 4 Vs对称PCR S A 1 1 引物的设计与筛选5 探针设计和筛选1 探针设计 探针设计和筛选2 探针的Tm值 探针设计和筛选3 退火温度的确定 探针用量的优化 探针设计和筛选4 不同TaqE的比较 Taq1 Taq2 反应体系的优化1 TaqE浓度的优化 0 5U T 1 0U T 2 0U T 3 0U T 反应体系的优化2 dNTP浓度的优化 反应体系的优化3 Mg2 对荧光强度的影响 Mg2 和退火温度的优化 方阵法 PCR促进剂的影响 AMV与M MLV的比较 M MLV的用量的优化 高浓度RNA 低浓度RNA 比较了四个浓度 24U T12U T8U T4U T RNA酶抑制剂浓度的优化 优化前后含量对比 逆转录时间的比较 逆转录时间 30min 45min 60min 反应程序的优化 RT PCR扩增程序优化 RT PCR扩增程序 优化前 42度 60分钟 95度 3分钟 95度 30秒 55度 20秒 逆转录 预变性 延伸 RT PCR扩增程序 优化后 42度 45分钟 95度 3分钟 95度 10秒 58度 45秒 逆转录 预变性 50个循环 45个循环 72度 20秒 退火 变性 退火延伸 反应程序的优化 变性 优化前后的比较 优化后 优化前 多色荧光PCR 双色荧光PCR三色荧光PCR多色荧光PCR 多色荧光PCR的特点 高效性 在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物 或对有多个型别的目的基因进行分型 特别是用一滴血就可检测多种病原体 系统性 多重PCR很适宜于成组病原体的检测 如肝炎病毒 肠道致病性细菌 性病 无芽胞厌氧菌 战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检 经济性 多种病原体在同一反应管内同时检出 将大大的节省时间 节省试剂 节约经费开支 为临床提供更多更准确的诊断信息 双色荧光PCR FAM JOE 三色荧光PCR 多色荧光PCR应注意的几个问题 HBV HCV HIV 3 探针设计问题 HVB Thankyou