实验 大肠杆菌感受态细胞制备及转化 1 实验目的 掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法掌握转化的方法技术了解转化过程中各因素对转化率的影响 2 实验背景简介 重组蛋白为什么表达量不高或不表达 重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量为什么偏小 有些大肠杆菌表达重组蛋白为什么没有活性 总是形成包涵体 3 基因表达体系 1 原核体系2 真核体系 4 pJLA50X系列 pcDNAII etcpET系列 T7promoter Novagen公司 pQE系列 T5promoter Qiagen公司 pMAL系列 周质表达 BioLabs公司 pGEX系列 GST融合表达 Pharmacia公司 pBAD系列 Arabinose诱导型 常用表达载体 pTYB系列 CBD融合 可以自我切割 BioLabs 5 受体细胞应具备的条件 外切酶和内切酶活性缺陷 recB recC hsdR 用于基因扩增或高效表达的受体细胞 recA 防止重组细菌扩散污染 生物武器除外 6 大肠杆菌 Escherichiacoli 遗传背景清楚 基因工程操作方便 商品化表达载体种类齐全 表达效率高 基本不分泌 易形成包含体 无正确折叠的立体结构 无加糖等修饰 7 枯草杆菌 Bacillussubtilis 分泌蛋白质能力强 一般有天然立体结构 无加糖修饰功能 培养液中蛋白酶活性高 重组蛋白易受蛋白酶的水解 质粒不稳定 8 大肠杆菌常用克隆菌株 JM109HB101DH5aXLblueTG1C600外切酶和内切酶活性缺陷 recB recC hsdR 及重组整合缺陷型 recA 9 BL21 DE3 pLysS 自身表达T7RNApolymerase适用pET系列等带T7启动子的载体M15 SG13009 自身表达T5RNApolymerase适用pQE系列等带T5启动子的载体BL21TrxB DE3 thioredoxinreductase突变Origami thioredoxinreductase glutathionereductase双突变适合带thioredoxinreductase的融合表达载体 帮助形成正确的二硫键BR21CodonPlusRIL 富含AT的真核生物基因的表达BR21CodonPlusRP 富含GC的真核生物基因的表达Rosetta gami 识别稀有密码和正确折叠 特殊的表达用菌株 10 体系选择 研究基因功能 大肠杆菌 裂殖酵母 昆虫细胞 CHO细胞多肽药物生产 大肠杆菌 毕氏酵母 CHO细胞 乳腺组织疫苗 大肠杆菌 酵母 单抗生产 杂交瘤细胞工业酶生产 各种微生物 11 受体菌与质粒的选择 受体菌 E ColiDH5 无Ap抗性外源质粒Ampr抗性基因编码一种周质酶 内酰胺酶 可特异地切割Amp的 内酰胺环 从而使其失去杀菌能力选择 如进行蓝白斑筛选时可选用DH5 JM109 TG1 用T7启动子进行原核表达时可选用BL21 DE3 12 0 感受态及转化实验原理 定义感受态 Competence 细菌处于容易吸收外源DNA的状态转化 transformation 异源DNA分子导入受体细胞的过程致敏过程 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作 13 细菌产生感受态的类型 自然转化 naturaltransformation 在生长周期的任何时刻自动产生感受态 e g 枯草杆菌 工程转化 engineeredtransformation 在生长周期的特定时刻产生感受态 e g 大肠杆菌 14 感受态细胞形成的两种假说 1 局部原生质体化假说 细胞表面的细胞壁结构发生变化 即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁 使DNA分子能通过质膜进细胞 2 酶受体假说 感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点 使DNA分子能进入细胞 15 大肠杆菌感受态细胞制备的原理 大肠杆菌自然条件下很难进行转化 其主要原因是转化因子的吸收较为困难 在转化实验中 通常先采用人工的方法制备感受态细胞 代表性的方法之一是Ca2 诱导法 感受态形成后 细胞生理状态会发生改变 出现各种蛋白质和酶 负责供体DNA的结合和加工等 细胞表面正电荷增加 通透性增加 形成能接受外来的DNA分子的受体位点等 16 Ca2 诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化 在0 的Cacl2低渗溶液中 细菌细胞发生膨胀 同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构 促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来 诱导大肠杆菌形成感受态 Ca2 能与加入的DNA分子结合 形成抗DNA酶 DNase 的羟基 磷酸钙复合物 并黏附在细菌细胞膜的外表面上 当42 热刺激短暂处理细菌细胞时 细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动 并随之出现许多间隙 为DNA分子提供了进入细胞的通道 17 18 该法重复性好 操作简便快捷 适用于成批制备感受态细胞 对这种感受态细胞进行转化 每 g质粒DNA可以获得5 106 2 l07个转化茵落 完全可以满足质粒的常规克隆的需要 19 制备感受态细胞方法 原生质体法电击法特殊试剂诱导法 CaCl2诱导法 20 可能的转化机制 分子转化过程分以下几步 吸附 双链 分子吸附于受体菌表面 转入 双链 分子解链 一条链进入受体菌 另一条降解 自稳 外源质粒 分子在细胞内复制成双链 表达 供体基因随同复制子同时复制 分裂 转录翻译 21 重组子的筛选 这和受体菌 质粒 的选择相关 原则上要注意 受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定 重组子的筛选方法常用的有两种方法 抗生素筛选法互补法 22 抗生素筛选法 菌株为某种抗生缺陷型 而质粒上带有该抗性基因 如氨苄青霉素等 这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出 本实验利用抗生筛选转化子 23 互补法 许多载体都具有一段大肠杆菌 半乳糖苷酶的启动子及其 肽链的DNA序列 此结构称为lacZ 基因 LacZ 基因编码的 肽链是 半乳糖苷酶的氨基端的短片段 146个氨基酸 宿主细菌带有 半乳糖苷酶C端部分序列 宿主细菌和质粒编码的片段各自都不具有酶活性 但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的 半乳糖苷酶分子 LacZ 基因编码的 肽链与失去了正常氨基端的 半乳糖苷酶突变体互补 这种现象称为 互补 24 互补 25 影响转化效率的因素 细菌的生长状态 大肠杆菌在对数中期易产生感受态OD值 0 3 0 5 5X107个 ml 试剂的质量 化合物及无机离子 Rb Mn 二甲亚砜等质粒 大小 构型外源DNA 质粒 与细胞的比例 器皿的洁净度污染 尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行 26 感受态细胞的保存 制备好的感受态细胞每100uL分装一支EP管轻轻混匀 可以用tip头轻轻搅匀 4 保存 不加甘油 可保存一周 加30 甘油 20 保存 可保存一月 加30 甘油 80 保存 可保存六月 27 实验器材 摇床分光光度计冷冻离心机超净工作台恒温水浴涂布棒恒温培养箱 28 实验试剂 LB液体培养基LB固体培养基氨苄青霉素0 1MCaCl230 甘油 29 实验流程 30 实验操作步骤 1 挑取一DH5 单菌落于2 5mlLB培养液中37 过夜培养 31 2 取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中 37 振摇培养至OD600值达到0 5 0 6之间 32 3 取1 5ml菌液置于离心管内 4 4500g离心5分钟 每组制备2管感受态菌 33 4 加入1ml 100mM的冰冷CaCl2溶液 摇荡重悬细胞 冰浴30分钟 34 5 4 4500g离心5分钟收集细胞后 加0 1ml 100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞 冰上放置几分钟 即成感受态细胞悬液 35 6 感受态细胞分装成100 l的小份 暂且不用的贮存于 70 可保存半年 取其中一份进行转化 36 7 取50ul感受态菌入转化管中并加入DNA 不超过1ul 轻度摇晃混合后于冰上放置10分钟 37 8 将上述混合物转移到预热到42 的水浴锅中 热休克90秒 不要摇动试管 然后将试管迅速转移到冰浴 冷却1 2分钟 38 9 向管内加入950ul的LB培养液 然后37 200rpm摇床培养30分钟 39 10 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上 用灭过菌的玻璃棒涂布均匀 室温放置几分钟 40 11 倒置平板于37 培养12 16个小时 41 每组做质粒DNA的转化 每50 L感受态细胞悬液中加入2 L质粒DNA 轻轻摇匀 同时设置三组对照 1 不加质粒 2 不加受体菌 3 加已知具有转化活性的质粒DNA 具体操作按下表进行 在转化菌复苏时制备四块LB琼脂平板 其中一块不加Amp 另三块加Amp 并作好标记 42 实验流程 1 接单菌落到5mlLB液体培养基中 370C 190rpm振荡培养过夜2 5 250ul 菌液接种到含5mlLB的试管中 370C振荡培养1 2小时 至OD6000 4 0 5 已完成 3 将1 5mL菌液转移到离心管中4 离心5000rpm 40C 5min5 倒出培养液 43 6 用冰预冷的1mL0 1M的CaCl2处理 悬浮细胞 7 冰上20min8 5000rpm离心5min 倾去上清9 100uLCaCl2轻轻悬浮 冰浴 大肠杆菌DH5 感受态的制备 44 实验流程 大肠杆菌DH5 受态的制备 1ml 20min 45 实验流程 质粒的转化 1 实验样品 吸取50uL感受态细胞到另一个1 5mlEP管中 加入1uL质粒 枪头轻轻混匀 勿吹打 2 阴性对照 DH5 感受态细胞50uL 1uL无菌水冰浴20mins42 90秒 静置 勿摇动 迅速放到冰上 冰浴2mins加入950uLLB培养基 标明组号 37 200rpm摇床培养45mins 46 制备LB琼脂平板 自己制备 含Ap的LB固体培养基倒平板 不含Ap的LB固体培养基平板 涂布实验样品和阴性对照 各100uL涂布于Ap 平板 阴性对照100uL 涂布于Ap 平板 培养静置15mins 倒置平板37 培养过夜 47 转化率计算 转化效率的计算 转化子总数 菌落数 转化反应原液总体积 涂板菌液体积 转化效率 每微克质粒DNA的转化子数 转化子总数 个转化子 加入质粒DNA的量 g 48 含Ap的LB固体培养基倒平板 不含Ap的LB固体培养基平板 涂布实验样品和阴性对照 各100uL涂布于Ap 平板 阴性对照100uL 涂布于Ap 平板 制备LB琼脂平板 实验结果报告 49 实验关键点 无菌操作低温操作 50 观察结果 明天上午 预期实验结果 平板上出若干单菌落 说明 平板上没有可见菌落 说明 平板上出现大量菌落 说明 计数单菌落 计算转化率 51 如阴性对照中长出菌 可能原因是什么 菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落 它们是非Amp抗性的 试分析原因 思考题 52 1 何谓感受态细胞 制备感受态细胞的理论依据是什么 2 为什么通常使用R M 菌作为基因工程受体菌 3 简述CaCl2制备细菌感受态细胞及其转化的基本原理 53 涂布棒的使用 酒精灯的使用使用前 浸入75 酒精中 在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精 不要烧到手 等酒精烧完后 让涂布棒在空气中冷却 涂布均匀 将涂布棒重新除菌以备下一次使用 54 什么是蓝 白斑筛选 怎么进行蓝 白斑筛选 重组质粒转化宿主细胞后 还需对转化菌落进行筛选鉴定 利用 互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法 由 互补而形成的有功能活性的 半乳糖苷酶 可以用X gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 显色出来 它能将无色的化合物X gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5 溴 4 靛蓝 因此 任何携带着lacZ 基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种 半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后 在IPTG 异丙基硫代 D 半乳糖苷 诱导后 便会产生出有功能活性的 半乳糖苷酶 在含有X gal的培养基平板上形成蓝色菌落 而当有外源DNA片段插入到位于lacZ 中的多克隆位点后 就会破坏