细胞爬片及细胞骨架组分的荧光染色观察实验目的1巩固细胞传代技术。2掌握细胞爬片的方法。 3. 为细胞骨架的观察提供实验材料4. 学习荧光显微镜的工作原理及使用方法。5.掌握细胞骨架的显示方法6.了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构7.了解荧光探针 Hoechst 33342（Ho.33324 ）与细胞成分的结合特性和光谱特性。实验原理细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等。细胞骨架(cytoskeleton ）是真核 细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。细胞骨架包括微丝、微管和中间纤维。细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。本次试验使用鬼笔环肽对微丝进行染色。鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. 此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用. 因此, 用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法. Hoechst 33342 是一种亲脂性物质，能与 DNA 特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射波长分别为 350 nm 和 461 nm。罗丹明 123 是一种亲脂性的阳离子荧光探针。用它来标记线粒体是由于线粒体的基质对于膜间隙具有负电荷，而罗丹明 123 具有正电荷，两者电性相吸。所以能较好地观察线粒体的形态变化。荧光激发和发射波长为 507 nm 和 529 nm。试验方法材料：鸡胚成纤维细胞 试 剂:1. 细胞爬片：DMEM 培养基、血清、抗生素、胰酶2. 细胞骨架荧光染色：PEM 缓冲液（50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇） ，0.5% Triton X-100 溶于 PEM 缓冲液中， 4%多聚甲醛溶于 PEM 缓冲液中。仪器及用品：超净工作台、CO2 培养箱、倒置相差显微镜、盖玻片（无菌） 、35mm 细胞培养皿、小盖玻片、试管、移液管，滴管，酒精灯、75酒精棉球、废液缸。步骤：1.将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。2.用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入 35mm 培养皿中。3.打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉或吸出培养基。4.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，使其湿润整个细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。5. 显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、变圆，细胞边界清晰时，即可竖立或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶。6. 加两滴管含 10%FCS 的 DMEM 培养基反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，7. 用无菌小镊子将处理好的小载玻片放入 35mm 培养皿中，加入细胞悬液到液体布满整个玻片又不会溢出玻片边缘，稍微静置，继续滴加培养基覆盖培养皿底部。8. 将细胞放入 5%CO2、37 培养箱培养至细胞融合度达 70%80% 。9. 取出培养有细胞的小盖玻片，置于小平皿中用 37预温 PEM 轻轻漂洗 3 次。10. 加入 37预温 4%多聚甲醛固定 15min 。11. 用 37预温 PEM 漂洗 3 次。12. 加入 0.5 % Triton X-100 通透处理约 10 min13. 用 37预温 PEM 漂洗 3 次。14. 取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上上滴加20 L 60 nM Alex phalloidin，将经上述处理的盖玻片细胞面向下孵育于染色液中，于湿盒中室温避光染色 30 min。15. 小心取下盖玻片，将其置于小平皿中，用 37预温 PEM 避光漂洗 3 次。16.在 parafilm 膜上滴加 Ho.33342 工作液各 10 L，将盖玻片上的细胞倒扣在 parafilm 膜上室温暗处孵育 10 min。17. 荧光显微镜观察微丝（绿光激发，产生红色荧光）核（紫外光激发，产生蓝色荧光）18.使用 emageJ 软件将两种染色的照片拼合。实验结果鸡胚成纤维细胞细胞骨架荧光染色鸡胚成纤维细胞的生长状况较好，有一定数目的细胞附着在玻片上，所以可用于骨架荧光染色。染色后微丝呈红色，细胞核为蓝色，染色较为清晰。分析与讨论细胞内的微丝在含有 ATP 和 Ca2+及低浓度的 Na+，K+等阳离子溶液中，趋于解聚成 G-actin；而在 Mg2+和高浓度的 Na+，K+等阳离子溶液中， G-actin 则装配为 F-actin。PEM 缓冲液提供高 Mg 环境，让单体肌动蛋白（G-actin ）聚合成丝状肌动蛋白（ F-actin）。同时，EGTA 能螯合 Ca2+，使 G-actin 装配成 F-actin，微丝骨架保持聚合状态且较为舒张。用 PEM缓冲液处理细胞，能够模拟体内环境并提高细胞骨架的稳定性。0.5%Triton X-100 处理细胞的作用是溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，增加细胞膜的通透性，使荧光染料能够更容易地透过细胞膜与 F-actin 特异性结合。鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优点：鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和 TRITON X-100 处理。鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合，通过让这种毒素吸附于荧光染料上面，可以研究细胞的内部工作机制，窥视细胞如何分裂。鬼笔环肽用于细胞骨架研究的缺点：对细胞有毒性，价格昂贵。