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生物化学实验报告姓 名: 汪煜灵 学 号: 3130010071 专业年级: 2013 级临床医学 组 别: 第 2 实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称 肝糖原的提取、鉴定、分离实验日期 2014-12-25 实验地点 第 2 实验室合作者 陈海玲 指导老师 朱利娜评分 教师签名 批改日期1、实验目的1、掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、熟练运用溶液混匀的各种方法。5、正确掌握溶液转移的操作。6、正确操作使用分光光度计。2、实验原理 肝糖原的提取糖原储存于细胞内,采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用 95%乙醇将绿叶中糖原沉淀,再溶于热水中。 糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的的存在。CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)22Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H 2O2CuOH = H20 + Cu2O (红色)Cu(OH)2 = H2O + CuO (黑色) 肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在 10100mg 范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其他成分,而保留肝糖原。3、实验材料 仪器:1、普通离心机,室温-100恒温水浴箱(x2),722 型分光光度计,精度为 10mg 级电子天平2、剪刀、镊子、研钵3、试管架,离心管,试管4、刻度吸量管(2ml ,5ml),1000l 微量可调取液器5、100ml 容量瓶6、白瓷反应板 试剂:鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH 溶液、标准葡萄糖液(50mg/L)蒽酮显色剂4、实验步骤 肝糖原的提取鸡肝约 1.5g,剪碎研磨至乳状研磨成肝匀浆全部转入离心管中,离心 3min(4000r/min)取上清液离心 5min(4000r/min)取沉淀沸水浴 2min,溶解沉淀糖原溶液 1ml 白瓷板中沸水浴加热 15min,冷却加碘试剂 0.1ml 加碘试剂 0.1ml糖原溶液 0.1ml糖原水解液 0.1ml(2d) 糖原水解液呈色对比混匀沸水浴 2min,观察变化 注意事项:+5ml 95%乙醇,混匀,静置 10min+5%CCl3COOH 1ml+5%CCl3COOH 3ml+蒸馏水 2ml+50% NaOH 0.2ml+班氏试剂 0.2ml(4d)+浓 HCl 0.2ml1、提取肝糖原时,向上清液中加入等量的 95%乙醇后,必须混匀。由于上清液为水溶液,比重大于 95%乙醇,溶液分成两层。加之上清液已 4ml 多,加上等量乙醇,总量接近 9ml,混匀操作比较困难,最好用倾倒混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在 20 个以下的会使碘呈现红色,20-30 个之间使碘呈现紫色,60 个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长,故呈蓝色,而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在 20 个以下(通常 8-12 个葡萄糖残基),吸附碘后呈现红棕色。3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时,加班氏试剂不能过量,否则反应液呈黑色浑浊,观察不到应有的结果。 肝糖原定量测定鸡肝 0.15 g沸水浴 15min冷却,全部转入 100ml 容量瓶中加水至标线,仔细混匀,获得糖原提取液取 3 支干净的试管,按下表操作:试剂(ml) 空白管 标准管 样品管蒸馏水 1.0 标准葡萄糖溶液 1.0 糖原提取液 1.00.2%蒽酮溶液 2.5 2.5 2.5混匀,沸水浴 10min,冷却。在 722 型或 721 型分光光度计 620nm 波长处,用空白管溶液调零,测定各管溶液的吸光度(A).计算:肝糖原(g/100g 肝组织)= X 0.05 X X X 1.11标 准测 定A)肝 组 织 重 ( g1010+30% KOH 1.5ml5、实验现象与结果讨论 糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色,但与碘试剂原来颜色区别不大。 鸡肝加碱沸水浴后分层,上层为红棕色,下层无色。 加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管(由左至右)对比 将空白管在 620nm 处的 A 值设定为 0,测得标准管、样品管的 A 值如下:空白管 标准管 样品管1 0 0.610 0.0852 0 0.612 0.0853 0 0.616 0.091平均值 0 0.613 0.087肝糖原(g/100g 肝组织)= X 0.05 X X X 1.11标 准测 定A)肝 组 织 重 ( g10100.525从肝糖原的定量试验中可知鸡肝样品中含有糖原,但在定性实验中结果不明显,可判断实验所采用的鸡肝样品含糖原量比较少,造成鸡肝糖原量少的原因可能是用于实验的鸡处于饥饿状态,糖原分解以维持血糖稳定,因此使肝中剩余的糖原量少于非饥饿状态下的鸡的肝糖原含量。
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