资源预览内容
第1页 / 共6页
第2页 / 共6页
第3页 / 共6页
第4页 / 共6页
第5页 / 共6页
第6页 / 共6页
亲,该文档总共6页全部预览完了,如果喜欢就下载吧!
资源描述
包涵体表达的蛋白的复性摘要 综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。关键词 包涵体 蛋白质 复性Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.Key words inclusion body , protein , renaturation 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成,虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点,但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。一、包涵体:1.1 包涵体的定义、组成与特性:包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形成无活性的固体颗粒。 一般含有 50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA 聚合酶、内毒素、外膜蛋白 ompC、ompF 和 ompA 等,环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为 0.5-1um,具有很高的密度(约 1.3mg/ml) ,无定形,呈非水溶性,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR 等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构,他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 11.2 包涵体的形成:主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子,或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。1.2.1、基因工程菌的表达产率过高,超过了细菌正常的代谢水平,由于细菌的 因子的蛋白水解能力达到饱和,使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。1.2.3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内 pH 接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子,如折叠酶和分子伴侣等,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。1.2.5、蛋白质在合成之后,于中性 pH 或接近中性 pH 的环境下,其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键,即是说,有的表达产率很高,如 Aspartase 和 Cyanase,表达产率达菌体蛋白的 30%,也不形成包涵体,而以可溶形式出现。 21.2.6、在细菌分泌的某个阶段,蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。1.3 包涵体破菌、分离、洗涤及溶解1.3.1 基因工程菌发酵液,经离心浓缩后,可用:机械破碎、超声破碎:单纯超声破碎,在小规模下且菌量较少的情况下效果较好,由于能量传递和局部产热等原因,很难用于大体积细胞悬液的破碎,这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起,给后期纯化带来困难。因此,在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜,再结合超声破碎方法,可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以 5000-20000g 15min 离心,可使大多数包涵体沉淀,与可溶性蛋白分离。1.3.2 洗涤:为了除去包涵体上粘附的杂质,如膜蛋白或核酸,应用洗涤液洗涤包涵体,通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解,如 2M 尿素在 50mM Tris pH7.0-8.5 左右,1mM EDTA 中洗涤。此外可以用温和去垢剂 TritonX-100 洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 31.3.3 溶解:一般用强的变性剂如尿素(6-8M ) 、盐酸胍(GdnHCl 6M) ,通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,一般来讲,盐酸胍优于尿素,因为盐酸胍是较尿素强的变性剂,它能使尿素不能溶解的包涵体溶解,而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化,特别是在碱性 pH 值下长期保温时。或用去垢剂,如 SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl 等,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha 等人用 TritonX-100 来溶解 Zymononas mobilis levansucrase 包涵体蛋白。另外,对于含有半胱氨酸的蛋白质,分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT) 、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM 2-BME 或 DTT,也有文献使用 5mM 浓度。在较粗放的条件下,可以使用 5ml/l 的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关,而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响,如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶,有时还原剂的使用也是必要的,可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。 4二、复性:由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性,加上剧烈的处理条件,使蛋白的高级结构破坏,因此重组蛋白的复性特别必要。 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度 4M 左右时复性过程开始,到 2M 左右时结束。对于盐酸胍而言,可以从 4M 开始,到 1.5M 时复性过程已经结束。2.1 包涵体蛋白复性方法2.1.1 稀释复性:直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。2.1.2 透析复性:好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成无活性蛋白质聚体,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模。2.1.3 超滤复性:在生产中较多的使用,规模较大,易于对透析速度进行控制,缺点是不适合样品量较少的情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。2.1.4 柱上复性:是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法,包涵体蛋白变性后,在色谱柱上复性,大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用 Sephacry1S-100 或Superdex75 等分子筛填料,柱较长( 40cm-100cm 不等) 。相比稀释和透析两种方法,色谱柱复性回收率高(高达 90%以上) 、快速、易放大,样品稀释倍数小(一般五倍左右) 52.1.5 高蛋白质浓度下的复性:通常有两种方法,一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性;二是采用温度跳跃式复性,即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成,当形成聚集体的中间体已经减少时,迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。此外,吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。2.2 包涵体蛋白复性效率复性是一个非常复杂的过程,除与蛋白质复性的过程控制相关外,还很大程度上与蛋白质本身的性质有关,有些蛋白非常容易复性,如牛胰 RNA 酶有 12 对二硫键,在较宽松的条件下复性效率可以达到 95%以上,而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如 IL-11,很多蛋白的复性效率只有百分之零点几,如在纯化 IL-2 时以十二烷基硫酸钠溶液中加入铜离子( 0.05%SDS,7.5-30u mol/l CuCl 2)的方法,25-37C 下反应 3 小时,再 EDTA 至 1m mol/l 终止反应,复性后的二聚体低于 1%。 6一般说来,蛋白质的复性效率在 20%左右。2.2.1 影响复性效率的因素: 2.2.1.1 蛋白质的复性浓度:正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用,蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素,因而,一般浓度控制在 0.1-1mg/ml;如果变性蛋白加入复性液中过快,容易形成絮状沉淀,可能是蛋白重新凝聚的缘故。所以我们采用再水浴和磁力搅拌下,逐滴加入变性蛋白,使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。2.2.1.2pH 和温度:复性缓冲液的 pH 值必须在 7.0 以上,这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成,过高或过低会降低复性效率,最适宜的复性 pH 值一般是 8.0-9.0。 12此外,影响复性效率的因素还有,变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。2.2.2 提高包涵体蛋白的复性产率2.2.2.1 氧化-还原转换系统对于含有二硫键的蛋白,复性过程应能够促使二硫键形成。常用的方法有:空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及 DTT 再氧化法.最常用的氧化交换系统是 GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine 、DTT/GSSG 、DTE/GSSG 等也都有应用。氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。通常使用 1-3m mol/l 还原型巯基试剂,还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为 10:15:1。 72.2.2.2 添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠,但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性,或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。如盐酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用,如蛋白质的辅因子 Zn2+或 Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而防止了蛋白质的聚集,加入浓度大于 0.4 mol/lTris 缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率。浓度为 0.4-0.6M L-Arg 有助于增加复性中间产物的溶解度。成功的应用于很多蛋白如 t-PA 的复性中,可以抑制二聚体的形成。NDSBs 是近年来出现的可促进蛋白复性的新家族, NDSBs 由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短的疏水集团组成,故不属于去垢剂,不会形成微束,易于透析去除,目前,常用的有 NDSB-195,NDSB-201,NDSB-256 。 82.2.2.3PEG-NaSO4 两相法用 PEG 和 NaSO4 作为成相剂,然后加入盐酸胍,再把变性的还原的蛋白质溶液加入其中进行复性,但这种方法需复性的变性蛋白质的浓度必须低。 92.2.2.4 分子伴侣和折叠酶等 这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰-辅氨酰顺反异构酶、分子伴侣、FK506 结合蛋白、Cyclophilin 等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡,而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。 132.2.2.5 其它提高复性率的策略还有许多,如:非离子型去垢剂,尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl 等对蛋白质复性有促进作用;待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性;多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的作用
网站客服QQ:2055934822
金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号