甲霜灵胶体金竞争法试纸条的研制 北京万华生物工程有限公司2005 12 8 一 前言 农药甲霜灵简介最高残留限量标准检测方法的建立分课题进展情况简单汇报 1 农药甲霜灵简介 农药甲霜灵 metalaxyl 又名阿普隆 雷多米尔 瑞毒霉 甲霜安 化学名称D L N 2 6 二甲基苯基 N 2 甲氧基乙基 氨基丙酸甲酯 属酰苯胺类杀菌剂 据中国农药毒性分级标准 属低毒杀菌剂 对卵菌引起的病害具有独特的保护和治疗作用 2 最大残留限量标准 联合国FAO WHO食品法委员会 CCPR 关于食品和饲料中农药最高残留限量的规定 中规定每日允许摄入量 ADI 为0 03mg kg体重 禾谷类植物最高允许残留量为0 05 10 6 中华人民共和国卫生部和中国国家标准化管理委员会于2005年1月25日发布 自2005年10月1日起实施中华人民共和国国家标准食品中农药最大残留限量标准 GB2763 2005 该标准中规定了农药甲霜灵在食品中的最大允许残留量 中华人民共和国国家标准甲霜灵在食品中最大残留限量标准 3 检测方法建立 甲霜灵不稳定 传统的气相色谱法检测困难 Krause在原有检测基础上进行改进 将高效液相色谱法 HPLC 应用于食物样本检测中 此方法普遍用于检测氨基甲酸酯类杀虫剂 虽然HPLC法具有更高的灵敏度 可以精确地对样品中的农药进行定性和定量分析 但此法要求精密复杂的仪器 而且需要专业人员操作 不适合于大批量样品的检测 胶体金免疫层析诊断技术是在单克隆抗体技术 免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术 具有快速 灵敏 操作简便 成本低 无需专业人员操作等特点 真正达到复杂原理与简易操作的统一 同时具有保存方便 有效期长等特点 与气相色谱法补充使用 具有灵敏度高 操作简便 检测迅速等特点 主要技术路线 4 分课题情况简单汇报 拟解决的关键技术 小分子免疫原的合成 与小分子免疫原抗原决定簇配对单克隆抗体的制备及胶体金研究 课题完成情况及效果 本课题已成功研制出合成免疫原N2B 进行免疫获得单克隆抗体N2B14E6C10 这一针对甲霜灵抗原决定簇配对的单克隆抗体 亲和力好 效价达到10 9 并成功制成甲霜灵胶体金检测试纸 应用竞争法胶体金检测试纸最低检出量可达0 3mg kg 达到国标要求 通过比对试验的验证 相关系数r 0 99996 说明方法的可靠性 因此 可以肯定胶体金免疫法在农药 兽药残留限量快速检测技术中 是最有效 最快速 最简便的方法 其优点在于灵敏度高 特异性强 操作简便 快速 常温储存等 是适合于现场检测的一种快速检测方法 是食品安全检测的一种手段 互补现有检测方法各自的优缺点 二 试验研究内容 免疫原合成抗体制备胶体金研究半成品研制及鉴定成品研制 1 免疫原合成 半抗原合成免疫原合成免疫原的鉴定小结 1 半抗原合成 将1 6gNaOH溶于200mL蒸馏水中 并加入10 056g甲霜灵 油浴50 下搅拌6h 用TLC检测 反应完全 用乙酸乙酯洗涤反应液 弃去酯相 水层用浓盐酸调pH值至1 0左右 析出白色物质 用乙酸乙酯再次萃取混合液 酯相用无水硫酸钠干燥过夜 抽滤酯相 旋转蒸除溶剂 得到白色固体物质 用正己烷和乙酸乙酯重结晶 抽滤后得到半抗原N2 甲霜灵酸 2 免疫原合成 称取0 265g甲霜灵酸 用8mLDMF溶解 加入0 258gDCC和0 125gNHS 用TLC监测反应完全程度 待反应完全后 抽滤反应液 用DMF洗涤两遍 称取2gBSA 用200mL0 2mol LpH值8 7的硼酸盐缓冲液溶解 将DMF溶液滴入到上述BSA溶液中 室温搅拌过夜 得到甲霜灵免疫原N2B 先用蒸馏水透析2天 再用生理盐水透析3天 每天换液2次 透析后的溶液于3000r min离心15min 取上清液于 20 下冷冻干燥 冻干后分装保存 同法可将甲霜灵酸连接到鸡卵清蛋白OVA上 合成检测原 N2A 3 免疫原的鉴定 紫外扫描 从紫外扫描图谱可以看出 N2B在274 5nm出现最大吸收峰 峰值为0 209ABS BSA在278 0nm出现最大吸收峰 峰值为0 083ABS 甲霜灵人工合成免疫原N2B在280nm左右的紫外吸收峰明显高于BSA在280nm的紫外吸收峰 所以通过紫外扫描可以证明 甲霜灵半抗原成功的连接到了载体蛋白BSA上 琼脂糖双扩散法鉴定 DADT结果显示 抗血清与免疫原 N2B BSA 检测原 N2A 均出现反应沉淀线 而与OVA 甲霜灵未产生可见的沉淀线 这说明抗血清中含有甲霜灵抗体和BSA抗体 不与OVA交叉反应 虽然与甲霜灵发生交叉反应 理论上推测 但不形成可见的沉淀线 DADT检测结果表明 N2B合成成功 即N2与BSA间通过化学键结合 4 小结 本试验通过化学合成法进行甲霜灵免疫原的制备 利用甲霜灵酸结构中的羧基 在适当的偶联剂作用下将其连接到载体蛋白 BSA 上 制成免疫原 通过紫外检测法 动物免疫试验对甲霜灵免疫原进行鉴定 证实免疫原合成成功 2 抗体制备 单克隆抗体制备多克隆抗体制备 1 单克隆抗体制备 单克隆抗体制备流程单克隆抗体特性鉴定小结 单克隆抗体制备流程 用合成的免疫原N2B免疫BALB C小鼠 在无菌条件下取免疫小鼠脾细胞与Sp2 0细胞融合 共融合6次 每次1只 用ELISA间接法从产生的267株阳性杂交瘤中 筛选出对甲霜灵抗原呈阳性反应的杂交瘤11株 注射小鼠185只 制备腹水419mL 纯化得到275 8mg抗体 结果表明 我们成功获得了能识别甲霜灵抗原决定簇的杂交瘤细胞株 N2B14E6C10 单克隆抗体鉴定 抗体的纯度鉴定 从图中可以看出N2B14E6C10在电泳中呈现1条带 纯度大于95 同时这株抗体分子量与97 4KD蛋白标准品相近 间接ELISA法检测抗体活性 从左图可以看出 当抗原浓度为0 32ng mL时 OD450是1 681 大于0 5 因此活性合格 间接ELISA法抗体特异性检测 由左图可以看出甲霜灵单抗只针对甲霜灵抗原特异 与其它无关抗原不发生反应 具有较好的特异性 抗体亲和力的鉴定 N2B14E6C10抗体亲和力表 用甲霜灵抗原包被直接筛选 结果显示 N2B14E6C10能识别甲霜灵抗原决定簇 经ProteinA柱直接纯化 亚类为IgG1的这株抗体纯度达到95 以上 抗体亲和力常数 6 72 0 507 109 可以满足用于制备检测试纸的检测线 小结 2 多克隆抗体制备 基本制备过程多克隆抗体活性鉴定小结 过程 动物免疫 多克隆抗体纯化 多抗活性鉴定 从左图可以看出 此羊抗属IgG抗体稀释浓度在31 25 g mL时清晰可见沉淀线 判定此抗体活性合格 多克隆抗体活性鉴定 羊抗鼠多克隆抗体 经活性鉴定合格 可以满足用于制备检测试纸的控制线 小结 3 胶体金研究 经过电镜结果分析 同甲萘威 我们可以得出 胶体金颗粒直径在20 30nm之间时 颗粒大小均匀 无聚合与沉淀现象 且灵敏度高 为最佳状态 此时与抗体的结合量为6 12mg 氯金酸与柠檬酸三钠溶液的配比为30mL 18 20mL 4 半成品研制及鉴定 原理胶体金检测试纸条的制作工艺流程半成品调试半成品鉴定小结 在硝酸纤维素膜上的检测区包被甲霜灵合成免疫原 对照区包被羊抗鼠多克隆抗体 当待测物中有被测的抗原物质 即甲霜灵 时 待测物中的抗原物质就会与标记胶体金的甲霜灵单克隆抗体形成Ag Ab Au复合物 复合物不与包被在硝酸纤维素膜上的甲霜灵合成免疫原结合 仅会在控制线处出现一条色带 C线 结果为阳性 说明被检测的样品中农药甲霜灵超标 当待测物质中没有被测的抗原物质时 标记胶体金的甲霜灵单克隆抗体就会与包被在硝酸纤维素膜上的甲霜灵合成免疫原结合 形成Ag Ab Au复合物 此时检测线处可看到一条明显色带 T线 因此当检测试纸上可看到两条线 C线和T线 时 结果为阴性 说明被检测的样品中农药甲霜灵未超标 原理 胶体金检测试纸条制作工艺流程 甲霜灵竞争法试纸条半成品灵敏度调试 敏感性鉴定取甲霜灵竞争法试纸条 依次浸入蒸馏水 浓度为10ng mL 50ng mL 100ng mL 300ng mL 500ng mL 1 g mL 2 g mL甲霜灵标准品中 5分钟内各试纸条均可见一条红色的控制线 其中蒸馏水和浓度为10ng mL 50ng mL 100ng mL的甲霜灵标准品在检测区和控制区均可见一条色带 为阴性 而浓度为300ng mL 500ng mL 1 g mL 2 g mL甲霜灵标准品仅在控制区出现一条色带 为阳性 半成品鉴定 图中试纸条从左到右依次是蒸馏水 浓度为10ng mL 50ng mL 100ng mL 300ng mL 500ng mL 1 g mL 2 g mL甲霜灵标准品的检测结果 结果分析 甲霜灵竞争法试纸条敏感度可达到300ng mL 检测标准品有梯度变化 灵敏度高 批间差小 性能稳定 阳性参考品符合率鉴定取甲霜灵竞争法试纸条 依次浸入浓度为300ng mL 500ng mL 800ng mL 1 g mL甲霜灵标准品中 5分钟内各试纸条仅可见一条红色的控制线 为阳性 图中试纸条从左到右依次是浓度为100ng mL 300ng mL 500ng mL 800ng mL 1 g mL甲霜灵标准品的检测结果 结果分析 甲霜灵竞争法试纸条性能稳定 特异性好 特异性鉴定取甲霜灵竞争法试纸条 依次浸入浓度均为100 g mL的草甘磷 甲基立枯磷 敌百虫 林丹 绿麦隆 甲基对硫磷 禾草灵 乙草胺 甲草胺 甲胺磷 甲萘威 毒死蜱 百菌清 莠去津样品中 5分钟内各试纸条在检测区和控制区均可见一条色带 为阴性 图中试纸条从左到右依次是浓度均为100 g mL的草甘磷 甲基立枯磷 敌百虫 林丹 绿麦隆 甲基对硫磷 禾草灵 乙草胺 甲草胺 甲胺磷 甲萘威 毒死蜱 百菌清 莠去津的检测结果 结果分析甲霜灵竞争法试纸条与浓度均为100 g mL的草甘磷 甲基立枯磷 敌百虫 林丹 绿麦隆 甲基对硫磷 禾草灵 乙草胺 甲草胺 甲胺磷 甲萘威 毒死蜱 百菌清 莠去津常用农药均无交叉反应 特异性好 精密度鉴定取甲霜灵竞争法试纸条 依次浸入300ng mL的甲霜灵标准品中 同批次 不同批次各平行检测10条 5分钟内各试纸条均可见一条红色的控制线 为阳性 每批试纸条是浓度为300ng mL甲霜灵标准品的检测结果 结果分析 甲霜灵竞争法试纸性能稳定 可重复性好 稳定性鉴定胶体金检测试纸条37 放置20天稳定性试验胶体金检测试纸条4 30 放置6个月稳定性试验 胶体金检测试纸条37 放置20天稳定性试验 取甲霜灵竞争法试纸条保存在37 放置20天 对产品每隔3天进行敏感性 阳性参考品符合率 特异性检测 敏感性 取保存在37 的甲霜灵竞争法试纸条依次浸在蒸馏水 浓度为10ng mL 50ng mL 100ng mL 300ng mL 500ng mL 1 g mL 2 g mL甲霜灵标准品中进行敏感性试验 5分钟内各试纸条均可见一条红色的控制线 其中蒸馏水和浓度为10ng mL 50ng mL 100ng mL的甲霜灵标准品在检测区和控制区均可见色带 为阴性 而浓度为300ng mL 500ng mL 1 g mL 2 g mL甲霜灵标准品仅在控制区出现一条色带 为阳性 37 条件下甲霜灵竞争法试纸条敏感度检测 阳性参考品符合率 取保存在37 的甲霜灵竞争法试纸条依次浸在浓度为300ng mL 500ng mL 800ng mL 1 g mL甲霜灵标准品中 进行阳性参考品符合率试验 5分钟内各试纸条仅可见一条红色的控制线 为阳性 37 条件下甲霜灵竞争法试纸条阳性参考品检测 特异性 取保存在37 的甲霜灵竞争法试纸条 依次浸入浓度均为100 g mL的草甘磷 甲基立枯磷 敌百虫 林丹 绿麦隆 甲基对硫磷 禾草灵 乙草胺 甲草胺 甲胺磷 甲萘威 毒死蜱 百菌清 莠去津中进行特异性试验 5分钟内各批次试纸条在控制区和检测区均可见一条色带 为阴性 37 条件下甲霜灵竞争法试纸条特异性检测 结果分