MSPvs BSP DNA甲基化检测专题 枫树海 树枝 4 DNA甲基化基本概念 1 2 3 5 DNA甲基化生物学作用 DNA甲基化检测意义 DNA甲基化检测方法 DNA甲基化PCR特点 目录 DNA甲基化PCR影响因素 6 DNA甲基化基本概念 DNA甲基化是由DNA甲基转移酶 DNAmethyl transferase Dnmts 催化S 腺苷甲硫氨酸作为甲基供体 将胞嘧啶转变为5 甲基胞嘧啶 mC 的一种反应 在真核生物DNA中 5 甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基 这种DNA修饰方式并没有改变基因序列 但是它调控了基因的表达 脊椎动物基因的甲基化状态有三种 持续的低甲基化状态 如管家基因 去甲基化状态 如发育阶段中的一些基因 高度甲基化状态 如女性的一条失活的X染色体 DNA甲基化主要形成5 Mc和少量的N6 甲基腺嘌呤 N6 mA 及7 甲基鸟嘌呤 7 mG 原核生物中CCA TGG和GATC常被甲基化 而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶 DNA甲基化是唯一发生在哺乳动物细胞内DNA合成后的修饰作用 是调节基因表达的机理之一 DNA甲基化能关闭某些基因的活性 去甲基化则诱导基因的重新活化和表达 DNA甲基化能引起染色质结构 DNA构象 DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变 从而控制基因表达 结构基因中广泛存在着相邻的两个CG 其中胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化且两个甲基基团在DNA双链大沟中呈特定三维结构 CpG CpG序列在哺乳动物基因组中出现的频率仅有1 远低于基因组中的其它双核苷酸序列 但在基因组的某些区域中 CpG序列密度很高 可以达均值的5倍以上 成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区 形成所谓的CpG岛 DNA甲基化基本概念 CpG岛 CpGIsland 结构基因组中70 90 的独立CpG都被甲基化 未甲基化的CpG成簇地聚集形成CpG岛 CpG岛主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域 约有60 以上基因的启动子含有CpG岛 结构基因启动子的核心序列及转录起始点 CpG岛的功能 通过甲基化与去甲基化 调控下游基因的表达 即基因表达的调控开关 DNA甲基化生物学作用 DNA甲基化是表观遗传学 Epigenetics 的重要组成部分 在维持正常细胞功能 遗传印记 胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用 是目前新的研究热点之一 研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化 例如 缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的 Li等1992年和Okano等1999年 此外 等位基因的抑制 allelicrepression 被印记控制区 imprintingcontrolregions ICRs 所调控 该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的 印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病 如 脐疝 巨舌 巨大发育综合征 Beckwith WiedemannSyndrome BWS 和Prader Willi Angelman综合征等 1 DNA甲基化与遗传印记 胚胎发育 2 DNA甲基化与肿瘤 目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因 因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生 因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测 而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现 并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著 因此甲基化的检测可用于肿瘤的分级 Uhlmann等发现不同病理类型及不同恶性程度的神经胶质瘤细胞的7种肿瘤标志基因存在着不同程度的甲基化 因此 甲基化的研究为肿瘤的早期预测 分类 分级及预后评估提供了新的依据 甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素 这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高 从而导致基因组的不稳定 如染色体的不稳定 可移动遗传因子的激活 原癌基因的表达和抑癌基因的不表达 继人类基因组计划结束后 2003年人类表观基因组协会 HumanEpigenomeConsortium HEC 宣布开始投资和实施人类表观基因组计划 HEP DNA甲基化检测意义 其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱 即不同组织与疾病状态下 5 甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱 以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传 胚胎发育 基因印记 等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用 随着对甲基化研究的不断深入 各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求 甲基化检测方法分为两类 甲基化分型 methylationtyping 甲基化图谱 methylationprofiling 后者又被称为甲基化组学 methylome 这些方法概括起来可分为三类 基因组整体水平的甲基化检测 基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找 DNA甲基化检测方法 甲基化分型技术通常应用于较少位点的检测 多为单基因的甲基化检测 甲基化图谱则是对大范围的基因甚至是全基因组的甲基化分析 根据研究所用处理方法不同 即DNA的甲基化修饰 指CpG二核昔酸中胞嘧啶的5位碳原子加上一个甲基基团 形成5甲基胞嘧啶 一般而言 可以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种 由于受到仪器等条件的制约 应用比较广泛的是前三种方法 1 甲基化敏感性内切酶 2 亚硫酸氢盐的修饰 3 特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白 4 质谱或色谱等精密检测手段 DNA甲基化PCR特点 结合重亚硫酸盐的测序法 BisulfiteGenomicSequence BSP 甲基化特异性的PCR methylation specificPCR MSP 重亚硫酸盐处理后 用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行PCR PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代 而甲基化的胞嘧啶位点保持不变 特异性高 能够提供高特异性的分析结果 这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的 灵敏度高 可以用于分析少于100个细胞的检测样品 用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图 重亚硫酸盐处理DNA后 基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变 关键 MSP中设计两对引物 即一对结合处理后的甲基化DNA链 M 另一对结合处理后的非甲基化DNA链 U 检测MSP扩增产物 如果用引物M能扩增出片段 则说明检测位点存在甲基化 若用引物U扩增出片段 则说明被检测的位点不存在甲基化 检测灵敏度高 样品消耗少 仅需1 g的基因组DNA 快速 简单 省时 DNA甲基化PCR影响因素 甲基化PCR扩增中存在许多因素可导致其扩增失败 调研分析发现引物设计的是否合理决定了甲基化PCR扩增的成败与否 而样本的处理好坏与反应温度的选择决定着甲基化PCR扩增产物的产量与纯度 总之 其影响因素归纳总结主要有以下几个方面 引物因素 反应体系因素 反应温度因素三大方面 1 引物因素 甲基化PCR引物设计的好坏是甲基化PCR扩增是否成功的关键因素 甲基化PCR引物设计原理 样品的DNA经亚硫酸盐处理后 发生甲基化的CpG岛碱基C不变 而未发生甲基化的CpG岛碱基C则变为尿嘧啶U 即C U 甲基化PCR的引物序列中至少含有一个CpG岛且该CpG岛应在3 端附近 最好是含有多个CpG岛 以保证引物的高特异性 同时可提高DNA甲基化碱基的检出率 甲基化PCR中未甲基化引物序列中正向引物不含鸟嘌呤碱基 G 反向引物不含胞嘧啶碱基 C 且引物设计尽可能满足普通PCR引物设计的原则 MSP所遇到的困难是 要扩增的是启动子或部分第一外显子序列 其CG含量相对较高 MSP扩增难度加大 因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5 0从理论上推测其扩增效率 对于扩增效率 30 的引物要进行优化 方法是 在核心启动子区域前后反复调整甲基化正向引物扩增起始点 以期使引物扩增效率增高 降低扩增难度 从而提高PCR产量 2 反应体系因素 甲基化PCR的反应体系一般与普通PCR体系一样 但针对甲基化PCR的DNA模板 须在抽提后检测其纯度和含量 其纯度要求A260 A280一定要在1 8 2 0之间 其含量准确测定 否则在亚硫酸盐处理时会因加入的DNA模板太多会导致DNA处理不完全而导致甲基化PCR扩增失败 而加入模板太少则会因目的片段少导致假阴性且浪费试剂 同时 甲基化PCR的DNA模板在抽提后要做一个初步电泳 看抽提的DNA模板是否完整 电泳后 若只有一条带则表明抽提的DNA模板是完整的 反之 得重新提取DNA 因为DNA模板的断裂处若正好是目的片段所在处 则会导致甲基化PCR扩增失败 Mg2 浓度一般在2 0 2 5mmol L为宜 过高或过低都不利于扩增 Taq酶一般选择针对富含GC等复杂二级结构模板的Buffer与酶 一旦使用不要轻易更换 以免MSP因重新优化引起时间和成本浪费 亚硫酸盐处理模板的过程要严格按照操作说明操作 避免DNA模板处理不完全 经亚硫酸盐处理后的 DNA模板应保存在 20 下 且使用不超过2M 3 反应温度因素 甲基化PCR扩增结果有三种情况 1 产物电泳为阴性 2 产物电泳出现多条非特异性带 3 产物电泳为阳性 出现1 2两种结果时 在保证反应体系和引物设计没问题的前提下 可通过调整甲基化PCR的反映温度去获取目的片段 由于PCR反应中 Tm的高低与GC含量呈正相关 因甲基化与未甲基化引物序列差异 在扩增过程中会出现PCR偏性 则可提高预变性温度 一般应 95 10min 和变性温度 95 1min 退火温度以60 做梯度或70 做降落PCR 亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3 0 3 9mol L 修饰时间控制在10 16h 修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化为尿嘧啶且DNA模板破坏加剧 时间过短会导致修饰不彻底 从而可能出现PCR只能扩出U M出不来 反应温度应控制在50 55 若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53 为好 DNA模板量应控制在 2ug为宜 以保证修饰完全 4 其他 引物设计 获取启动子区域序列1 http www genome ucsc edu 附 DNA甲基化引物设计步骤 2 http asia ensembl org index html redirect no 引物设计 设计引物1 附 DNA甲基化引物设计步骤 2 http www urogene org cgibin methprimer methprimer cgi 提取DNADNA甲基化检测与测序分析 附 DNA甲基化引物设计步骤 凝胶电泳检测测序分析 Thanks