中医学院 20 届毕业论文论文题目：吴茱萸对大鼠肝线粒体呼吸功能的影响课题来源：国家课题 论文性质：应用基础研究学生：XXXXXX 学生学号：XXXXXXXXXX所在班级：XXXXXXXXXXXXXXXXX院XXXXXXX班导师：XXXXXXXXXXXX 导师职称：XXXXXXXXX 导师：XXXXXXXXXXXX 导师签名：XXXXXXXXXXXX实习单位：XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX单位地址：XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX完成时间：XXXX年XX月目 录一、论文1、标题和作者？2、中文摘要及关键词？3、英文摘要及关键词？4、前言？5、正文？6、讨论或小结？7、参考文献？8、文献综述？9、致及声明？二、导师评阅意见表（单）三、优秀论文申报表（单）、优秀导师申报表（单）四、实习总结（单）五、优秀实习生申报表（单）、优秀实习组申报表（单）六、平时成绩表（单）吴茱萸对大鼠肝线粒体呼吸功能的影响吴玉霞（中医学院330004） 黄丽萍（中医学院药学院330004）中文摘要目的：本试验尝试从给药组与空白组表征大鼠肝脏线粒体呼吸功能各指标变化的角度，探索吴茱萸对机体呼吸功能的调控机制，以证实吴茱萸对大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响。方法：采用Clark氧电极法测定大鼠肝脏线粒体在密闭反应体系中耗氧的变化，以确定线粒体耗氧速率。结果：与空白组比较，给药组有较高的RCR，差异显著。结论：吴茱萸组通过加快态呼吸耗氧速率，降低态耗氧速率而提高RCR。关键词 吴茱萸； 肝脏线粒体； 呼吸功能ABSTRACTPurpose:To prove the effect of Evodia rutaecarpa on the respiratory system of mitochondria in mouse liver,the indes of these have been detected,and also the Regulatory mechanism.Methods:The Clark oxygen electrode is used to test the change of oxygen ,which consumed by mitochondrium in mouse liver ,to calculate the rate of the consumption of mitochondrial oxygen. Result: Compared with the blank group, the administration group have a higher level of RCR, and the difference was obvious. Conclusion：Evodia rutaecarpa is helpful to the higher level of RCR,by accelerating the rate of the oxygen consumption of state ,and reducing that of state .Key words Evodia rutaecarpa；liver mitochondria; respiratory chain function前 言 现代实验已证实,寒证的出现可能与人体能量代降低有关，由于能量代降低，身体热量不足，体温较低，呼吸缓慢，心跳减慢，心搏出量减少，体表毛细血管及小动脉反射性收缩，大脑皮层兴奋性减低而产生上述一系列“寒”的证候1。温里药具有温中散寒、补火助阳、回阳救逆等功效，通过提高能量代对于寒证患者有很好的调节作用。吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，属热性中药代表，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效。生物能量是维持机体生命的重要物质基础，能量代是人体物质代的最基本形式。线粒体是细胞活动的主要供能场所，是物质代和能量转化的中心站2。线粒体通过氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)生成大量ATP供应细胞各种化学反应与功能的能量需要3。本实验尝试从给药组与空白组表征大鼠肝脏线粒体呼吸功能各指标变化的角度，探索吴茱萸对大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响，以期探讨热性中药影响能量代的途径与机制。正 文1 试验材料1.1 试验动物 健康雄性SD大鼠40只，体重220士20g，由中医学院实验动物中心提供。动物质量合格证编号:SCXK（赣）20060001；将大鼠按随机数字表法分为4组，每组10只动物，分别为吴茱萸20天组、吴茱萸30天组、吴茱萸40天组、空白组。试验期间动物均饲养于同一环境下，保持室温1824，环境安静，动物随意进食进水，空白组给等体积生理盐水。所有动物于试验前12h禁食，但自由饮水。1.2 试验药材 吴茱萸，购自鹤元堂医药科技。1.3 试验试剂 蔗糖（solarbio）、甘露醇（天津市恒兴化学试剂制造）、EDTA-2K（国药集团化学试剂 批号：F20080423）、KCl（实验试剂 批号：200805025）、KH2PO4（天津市福城化学试剂厂 批号：20080913）、Tris（solarbio）、HCL（焱晨化工实业）、线粒体提取试剂盒（碧云天生物技术研究所）、考马斯亮蓝G-250（sigma公司）、琥珀酸钠（sigma公司）、ADP-2Na（sigma公司）、Janusgreen B（sigma公司）、95%乙醇（天津市恒兴化学试剂制造 批号：20090123）、85%磷酸（天津市恒兴化学试剂制造 批号：20081203）。1.4 仪器设备 782-1Channel Oxygen system（Strathkelvin Instruments）， 低温高速离心机（Thermo），-80冰箱（Thermo ），DY89-型电动匀浆机（新芝生物科技股份），SC-15数控超级恒温槽（新芝生物科技股份），722型可见分光光度计（欣茂仪器），Gilson P型移液器，Sartorius PB-10 PH计，ELGA purelab UHQ超纯水机，分析天平（1/100、1/1000、1/10000、1/100000）（Sartorius）。2 试验方法2.1 实验试剂配置2.1.1 线粒体呼吸功能反应介质：称取4.0991g的甘露醇、2.5673g蔗糖、0.1211g Tris 、0.0020g EDTA-2K、0.0373g KCL、0.0680g KH2PO4(PH=7.4)用双蒸水定容至100ml。2.1.2 线粒体提取缓冲液：称取21.393g蔗糖、0.151g Tris、0.101gEDTA-2K；(PH=7.4)用双蒸水定容至250ml。2.1.3 底物（0.4M 琥珀酸纳）：称取 1.62g琥珀酸钠用双蒸水定容至25ml。2.1.4 50mM ADP：称取0.02365gADP-2Na用双蒸水定容至1ml。2.2 吴茱萸水煎剂的制备 取2.0kg吴茱萸药材，加入10倍量水，浸泡60min，回流提取60min，倒出药液，残渣再加入8倍水，回流提取60min。合并两次药液，滤过、浓缩后制成吴茱萸水提液，制备成生药浓度为0.42g/ml，放置于-20冰箱保存备用。2.3 大鼠肝脏线粒体的制备2.3.1 大鼠实验前禁食12小时,动物麻醉后，迅速手术、切取肝脏组织。2.3.2 肝组织处理：迅速取出肝脏，移入25ml烧杯加入足量带冰渣生理盐水，将肝组织剪碎，清洗积血以尽可能减少残留血液。清洗完后迅速用滤纸吸干后用万分之一分析天平称取150mg肝脏组织，将称好的组织转移至预冷的玻璃电动匀浆器中，加入线粒体分离试剂，（注意：分离试剂要保存在4的冰水浴中）。2.3.3 匀浆：用玻璃电动匀浆器匀浆，（注意：匀浆器应置于冰水浴中）。2.3.4 离心：将匀浆分装在2个1.5ml的离心管，平衡离心，4下以600g离心5分钟，此时细胞核，红细胞和细胞碎块及各种细胞器分布在不同层次，轻轻倒出上清装进两个离心管，（注意：倾倒时必须小心勿将底部的细胞核倒出以保证所制备线粒体的纯度），平衡后11000rpm离心10分钟，将大部分上清倒出，所得褐色沉淀为最后制备的线粒体。取少量保存介质，将沉淀悬浮起来，用较大的Tip头缓慢的吹打均匀，操作中尽量避免出现气泡，取样测定蛋白浓度，此为最后制备的线粒体悬液，（整个线粒体制备过程均在4进行）。2.4 线粒体活性鉴定2.4.1 JanusgreenB染色原理：JanusgreenB是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜，解离后，有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体膜上，膜上的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈蓝绿色，而在胞质染料被还原成无色。有活性的线粒体被染成蓝绿色4。2.4.2 0.02%JanusgreenB配置:称取0.02g的JanusgreenB,用生理盐水定容至100ml,装入棕色瓶中。2.4.5 载玻片的制备：在载玻片上滴一滴线粒体溶液，再滴一滴0.02%JanusgreenB，混匀，然后盖住盖玻片。2.4.6 线粒体活性检测：将光学显微镜预热20min，再对制备好的载玻片进行观察。结果显示:视野中有大量呈蓝绿色游动的颗粒，提示提取的线粒体有较好的活性。见图1。图1 在光学显微镜40下观察用Janusgreen B染色的线粒体2.4 线粒体蛋白定量52.4.1 线粒体蛋白含量用Bradford法进行蛋白含量的测定，用标准的牛血清白蛋白作标准曲线，室温下测试。具体步骤为：试剂准备：100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水定容至1L,混匀，用滤纸过滤，4保存备用准备各种不同浓度的牛血清白蛋白标准液，2.5ug/100ul，5.0ug/100ul，10.0ug/100ul，20.0ug/100ul，14.0ug/100ul，每个浓度做三个样，以标准蛋白含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，作图，即得到一条标准曲线。见图2。 图2 蛋白定量标准曲线计算待测蛋白样品的浓度。取4支试管，1支作空白，3支留作测定管，分别加入生理盐水：100ul、60ul、60ul、60ul，向后3支测定管中加入40ul的线粒体提取液，使每支试管总体积为100ul。最后各试管中分别加入3.0ml考马斯亮兰 G250染色液，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。待测蛋白以及标准蛋白中加入3ml中的考马斯亮蓝，用漩涡混合器混匀后静置2分钟，用722型可见分光光度计分别测量其在595nm处的吸光度值。2.4.2加完试剂后室温下静置25分钟后，分别倒入0.5cm光径玻璃比色皿中，用可见分光光度计在波长为595nm处测定各样品的OD值，空白对照为第1号试管，即100ul双蒸水加3.0mlG-250染色液。