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选做实验 食物中核黄素含量测定(荧光法)()目的意义核黄素是机体的物质代谢和能量代谢中不可缺少的物质。通过测定食物中核黄素含量,可了解人体核黄素摄入情况。(二)原理核黄素受到波长为 440500nm 的光照射后能产生光黄素( luniflavin) ,此物质能产生较强的荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素浓度成正比。试液中再加人低亚硫酸钠(Na 2S2O4) ,将荧光素还原为无荧光物质。然后再测定试液中残余荧光物质的荧光强度,两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。(三)仪器与试剂1荧光光度计2高压消毒锅 3锥形烧瓶,核黄素吸附柱(如图 61)4. 1.0molL 盐酸溶液 吸取分析纯浓盐酸 83.3ml 于 1L 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度。5. 0.lmolL 盐酸溶液 将上液按 1:10 稀释。64氢氧化钠溶液,0.4氢氧化钠溶液。73高锰酸钾溶液。83过氧化氢溶液。9核黄素储备液(23ugml) 精确称取已干燥过的核黄素(在干燥器中放置 24h)25mg,加少量蒸馏水溶解后倒入 1L 容量瓶,加蒸馏水 500ml,加入2.4ml 冰醋酸,将其放在温水中摇动使颗粒完全溶解,冷却后稀释至刻度,加入少量甲苯,避光冷藏备用。 10. 核黄素工作液(0.lugml) 吸取上液 1.0ml,加水稀释至 250ml。避光,贮于 4冰箱中可保存 1 周。1120低亚硫酸钠溶液 用时现配,保存在冰水浴中,4h 内有效。12. 0.04溴甲酚绿指示剂 称取 0.1g 溴甲酚绿于小研钵中,加 1.4m1 0.4氢氧化钠溶液研磨,加少许水继续研磨直至完全溶解,加水稀释至250ml。13. 2.5molL 无水乙酸钠溶液 使用时现配制。1410木瓜蛋白酶溶液 使用前用 2.5molL 无水乙酸钠溶液配制。 1510淀粉酶溶液 使用前用 2.5molL 无水乙酸钠溶液配制。16. 洗脱液 丙酮:冰酷酸:水(5:2:9) 。(四)操作步骤整个操作过程需避光进行。1样品前处理 称取 210g 样品(约含 10200ug 核黄素)于 100ml 锥形瓶中,加人 50m1 0.1molL 盐酸,搅拌使样品颗粒分散均匀后,置于高压锅内,在 10.3104Pa 高压下水解样品 30min。水解液冷却后,加人 4氢氧化钠调 pH 至 4.5(取少许水解液用溴甲酚绿检验呈草绿色, pH 即为 4.5) 。2酶解(1)含有淀粉样品的水解液加入 3ml 10淀粉酶溶液,于 3740保温约16h。(2)含有高蛋白样品的水解液加人 3ml 10木瓜蛋白酶溶液,于 3740保温约 16h。上述酶水解液用蒸馏水定容至 100ml,过滤。滤液在 4冰箱可保存 1 周。3氧化去杂质 取试管 2 支分别编号 A 和 B,按表 61 操作。混匀后放置 2min 以氧化样品中的杂质与色素,再滴加 3过氧化氢至溶液褪色,以还原高锰酸钾。剧烈摇动试管,使多余氧气逸出。4核黄素的吸附与洗脱 吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上,然后称取 1g硅镁吸附剂湿法装柱(约 5cm 高) 。勿使柱内产生气泡,调节流速为 60 滴分钟左右。将 A 和 B 管内氧化后的液体通过吸附柱后,用约 20ml 热蒸馏水洗脱样品中的杂质,再用 5.0ml 洗脱液将核黄素洗脱,用具塞试管收集洗脱液,再用蒸馏水洗脱吸附柱,收集洗出的液体合并于具塞试管中,定容至 10ml,混匀后留待测荧光强度。5.测定荧光强度 选择激发波长为 420nm,发射波长为 520nm,测定样品管及标准管的荧光强度。然后,在各管的剩余液中加 0.1m1 20低亚硫酸钠溶液,立即混匀,在 20s 内测出各管的荧光值,作为各自的空白值。(五)结果计算F稀释倍数W样品重量, gS标准管中核黄素含量;ug(六)结果说明 1. 加入低亚硫酸钠的量不能过多以免影响荧光强度,加入后必须立即读数,否则核黄素又会被空气氧化为荧光型。2过氧化氢不宜多加,因会产生气泡而影响比色。3如加入高锰酸钾后有氧化锰细微褐色溶液混浊,可离心使之澄清。4. 不能用皂粉洗涤玻璃器材,应用硫酸重铬酸钾洗液浸洗,再以清水洗净,继以蒸馏水冲洗。
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