第十八章 高效液相色谱法highperformanceliquidchromatography HPLC 基本要求 掌握 反相键合相色谱法的分离机制 保留行为的主要影响因素和分离条件选择 化学键合相的性质 特点和种类及使用注意事项 流动相对色谱分离的影响 HPLC中的速率理论及其对选择实验条件的指导作用 定量分析方法 熟悉 反相离子对色谱法和正相键合相色谱法及其分离条件的选择 高效液相色谱仪的部件 紫外检测器和荧光检测器的检测原理和适用范围 了解 离子 手性和亲合三种色谱法 溶剂强度和选择性 混合溶剂强度参数的计算和流动相最优化方法 基本内容 18 1高效液相色谱法的主要类型和原理 18 2高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择 18 3高效液相色谱仪 18 4高效液相色谱分析方法 流动相为液体 采用高效固定相 以高压输送流动相的色谱法 引入气相色谱的塔板理论和速率理论及先进的实验技术和方法 通过改进固定相达到了高效 采用高压输送流动相 达到了高速 特点 分离效能高 分析速度快及仪器化 next 高效液相色谱法 高效液相色谱法与经典液相色谱法对比 高效液相色谱法与气相色谱法对比 第一节高效液相色谱法的主要类型和原理 一 基本类型 吸附色谱法 adsorptionchromatographyLSC 分配色谱法 partitionchromatographyLLC 离子交换色谱 ionexchangechromatographyIEC 空间排阻色谱 stericexclusionchromatographySEC 主要类型 化学键合相色谱法 bondedphasechromatographyBPC 离子对色谱法 pairedionchromatographyPIC 离子抑制色谱法 ionsuppressionchromatographyISC 亲合色谱法 affinitychromatographyAC 手性色谱法 chiralchromatographyCC 疏溶剂理论 疏溶剂缔合作用示意图l 键合烃基2 溶剂膜3 溶质的极性部分4 溶质的非极性部分 缔和 解缔和 1 反相离子抑制色谱 离子抑制剂 弱酸 弱碱性物质pH一定的缓冲溶液酸性物质 加入酸 如HAc tR K 碱性物质 加入碱 如NH3 H2O tR K 调节pH范围 2 0 8 0适用 pH 3 7弱酸 pH 7 8弱碱 两性化合物 3 反相离子抑制色谱和反相离子对色谱 2 反相离子对色谱法 适用 pH 离子对试剂种类及浓度 2 反相离子对色谱法 离子对试剂种类及浓度 适用 pH 第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择 一 化学键合相色谱的固定相 液 固吸附色谱法 固定相常用硅胶 高分子多孔微球 第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择 一 化学键合相色谱的固定相 优点 固定液不易流失 稳定 在pH2 8范围 热稳定性好 且能用于梯度洗脱 硅胶 烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1 尿嘧啶 2 苯酚 3 乙酰苯 4 硝基苯 5 苯甲酸甲酯 6 甲苯 键合量评价 含碳量 覆盖度 封尾 二 化学键合相色谱法的流动相 要求 与固定液不反应 对样品有良好溶解度k 1 10最佳k 2 5 与检测器匹配 粘度小 纯度高 流动相使用前需用微孔滤膜滤过 脱气 一 流动相对分离的影响 由填固充定质相量及决色定谱 受溶剂种类 选择性 影响 受溶剂配比 强度 影响 二 溶剂的强度和选择性 1 溶剂的极性和强度斯奈德 Snyder 溶剂极性参数 polarityparameter 正相色谱溶剂极性越强 洗脱能力越强 是强溶剂 反相色谱溶剂极性越弱 洗脱能力越强 是强溶剂 强度因子S 正相色谱 极性参数P 反相色谱 反相色谱常用溶剂的强度因子 强度因子S 正相键合相色谱法 式中和为纯溶剂i的极性参数及该溶剂在混合溶剂中的体积分数 2 混合溶剂的强度 反相键合相色谱法 原则 控制k 2 5 Xe lg K g e P Xd lg K g d P Xn lg K g n P 3 溶剂的选择性 依据 溶剂和溶质间的作用力 选择性参数 处于同一组中的各溶剂的作用力类型相同 在色谱分离中具有相似的选择性 而处于不同组别的溶剂 其选择性差别较大 三 流动相最优化方法 四面体法 a 四面体内的等洗脱面 ABC b 等洗脱面中10个初试实验溶剂的配比 A B C 三 分离条件选择 一 HPLC中的速率理论 与GC对比 GC H A B u C u 填充柱 或H B u C u 毛细管柱 HPLC H A C u 2 涡流扩散项及其影响因素 1 流动相流速对HPLC板高的影响 讨论 3 传质阻抗项及其影响因素 注 只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相的传质阻抗 m 色谱柱及填充情况决定的因子 涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响 HPLC法的分离条件 1 固定相的选择 小粒度 分布均匀的球形化学键合相固定相 dp 10 m 2 流动相及其流速的选择 选粘度小 低流速 1ml min 的流动相 甲醇或乙腈 3 柱温的选择 一般选室温250C左右 4 洗脱方式 等度洗脱 恒组成溶剂洗脱 梯度洗脱 第三节高效液相色谱仪 一 高效液相色谱仪流程图 1 贮液罐 滤棒 可滤去颗粒状物质 2 高压泵 输液泵 3 进样装置4 色谱柱 分离5 检测器 分析6 废液出口或组分收集器7 记录装置 输液泵 柱塞往复泵 压力 20 50MPa 特点 具有压力平稳 脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀等特性 输液泵 柱塞往复泵 1 等度洗脱 洗脱方式 2 梯度洗脱 梯度洗脱的优点 缩短分析周期 提高分离效果 改善峰形 很少拖尾 增加检测灵敏度 因峰变瘦 变高 但有时引起基线漂移及重复性不佳是其缺点 两种实现梯度洗脱的装置 高压梯度和低压梯度 二 进样系统和色谱柱 一 进样器流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置 其结构如图所示 二 色谱柱 柱体为直型不锈钢管 内径1 6mm 柱长5 40cm 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效 4 0mm 250mm 5 m 三 检测器 一 光电二极管阵列检测器 PDAD 二 蒸发光散射检测器 ELSD 第四节高效液相色谱分析方法 定性分析方法定量分析方法 外标法 内标法同GC 作业 3 13 19 三 分离条件选择 自学 一 HPLC中的速率理论 与GC对比 GC H A B u C u 填充柱 或H B u C u 毛细管柱 HPLC H A C u 2 涡流扩散项及其影响因素 1 流动相流速对HPLC板高的影 讨论 3 传质阻抗项及其影响因素 注 只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相的传质阻抗 m 色谱柱及填充情况决定的因子 涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响 HPLC法的分离条件 1 固定相的选择 小粒度 分布均匀的球形化学键合相固定相 dp 10 m 2 流动相及其流速的选择 选粘度小 低流速 1ml min 的流动相 甲醇或乙腈 3 柱温的选择 一般选室温250C左右 4 洗脱方式 等度洗脱 恒组成溶剂洗脱 梯度洗脱