基因工程概述一基因工程的概念操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因分子水平剪切拼接导入表达人类需要的基因产物由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。二基因工程的基本工具（一）“分子手术刀”限制性核酸内切酶（简称限制酶）1来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。2功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。3结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 （二）“分子针线”DNA连接酶1分类：根据酶的来源不同，可分为EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。两种DNA连接酶(EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键区别：EcoIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较DNA连接酶DNA聚合酶不同点连接的DNA双链单链模板不要模板要模板连接的对象2个DNA片段单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上相同点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质(三) “分子运输车”载体1.载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 2.基因工程常用的载体有： 质粒 、 噬菌体 和 动、植物病毒 等。最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。三基因工程的基本过程 (一) 获得目的基因（目的基因的获取）1.获取方法主要有两种：从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。用人工的方法合成。获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。2.利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至9095DNA解链为单链；第二步：冷却到5560，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至7075，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。（5）特点：指数形式扩增(二) 制备重组DNA分子（基因表达载体的构建） 1重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。2方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。(三) 转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法），其次还有基因枪介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。将目的基因导入微生物细胞：Ca处理法。(四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原抗体杂交技术。4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。3