装订线 摘 要固定化酶是酶工程的核心技术之一，有利于实验酶的重复使用及产物与酶的分离，将酶工程提高到一个新的水平，极大地促进了酶工程的研究与应用，并广泛应用于各个领域。本文综述了固定化酶的基本定义特点及其一些基本的载体使用材料，介绍了传统制备固定化酶方法和一些新的发现及研究方法，并总结了其在食品生产工业中的一些详细的应用，如在果汁、酒生产、乳制品业等其他方面的应用，促进了现代食品生产工业多方面的发展，并对其将来的发展进行了美好的展望。让我们对这一新兴物在生产中的应用有了一定的了解。关键字 固定化酶；制作方法；应用；前景目 录 1 引言. 32固定化酶的定义特点及其载体.32.1固定化酶的定义特点.32.2固定化酶的载体材料.43固定化酶的方法.53.1固定化酶的传统制定方法53.2改进酶的固定化进展. . 54固定化酶在食品工业中的应用.74.1固定化酶在柑橘汁加工中的应用.74.2固定化果胶酶在果汁加工中澄清的应用.74.3固定化酶在啤酒澄清中的应用.84.4固定化酶在乳制品中的应用.8 4.5固定化酶在制糖中的应用. .8 4.6固定化酶在茶叶加工中的应用.9 4.7 固定化酶在烟叶中的应用.9 4.8固定化酶在食品检测以及传感器中的应用.10结论 . 11致谢 12 参考文献131 引言酶是由活细胞产生的具有高效催化功能、高度一性和高度受控性的一类特殊蛋白质，它能特定促成某个化学反应而本身却不参加反应，具有反应效率高，条件温和， 反应产物污染小，能耗低，反应容易控制等特点，因此得到广泛的应用。但其在、碱、热及有机溶液等条件下易发生酶蛋白的变性，从而使酶活降低或丧失，而且酶反应多在溶液中进行，反应终了后不易回收，反应产物分离提纯困难，且难以实现工业上的连续化，自动化生产，因此酶工程的应用发受到了很大的限制。固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一项生物工程技术。酶的固定化(demobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术1。 固定化酶的研究不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且因为其节省能源与资源、减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求2。特别是在食品生产工业中有特别的作用，本文将在下面内容中做详细介绍。其在食品生产工业的发展前景美好广阔。 2 固定化酶的定义特点及其载体2.1固定化酶的定义特点固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上，进行催化、生产，因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。从固定化酶的发现、研究、发展到现在技术日趋精益 ，都是在不断进行着提升优越性能，不断的降低其不足因素带来的影响。它的优势有：( a ) 易于将固定化酶与底物、产物分开，方便后续的分离和纯化； ( b ) 酶的稳定性和最适温度提高，最适pH值改变，对温度和pH值适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低； ( c ) 可以增加产物的收率，提高产物质量； ( d ）可以在较长时间内连续生产； ( e ) 酶反应条件容易控制；( f ) 较水溶性酶更适合于多酶反应； ( g ) 酶的使用效率高，使用成本低 ( h ) 适于产业化、连续化、自动化生产。与此同时，由于酶的分离、固定化处理等原因，固定化酶也具有一些难以避免的缺点：在固定化过程中，酶活力会损失，生产成本提高，工厂初期投资大，只能用于水溶性底物，适合于小分子，不适宜于多酶反应，还需要需要辅助因子的协助才可以有效反应3-4。2.2固定化酶的载体材料 固定化酶中应用的载体可分为有机高分子载体、无机载复合载体三大类。 2 .2.1 有机高分子载体 有机高分子载体有二类。一类是天然高分子载体材料。此类材料一般无毒性，传质好，但强度较低，在厌氧条件下易被微生物分解，寿命短。常见琼脂、海藻酸钠等。 近年来研究比较热门的新载体是甲壳素和壳聚糖及其衍生物、丝素膜(家蚕丝纤维)。 另一类是合成有机高分子载体材料。一般来说强度大，但性能较差。这类材料种类很多，有聚乙烯醇(PVA)冷冻胶、烯氧化物载体、无孔聚烯(PS)聚苯乙烯磺酸钠 (PNaSS)微球载体、球状纤维素单宁树脂和多孔醋酸纤球形载体等。2 .2.2 无机载体材料 无机载体材料具有一些有机材料不具备的优点，如稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性，不易被微生物分解，耐酸碱，成本低，寿命长等。目前，对无机载体加以修饰，使之与酶和细胞结合的技术取得了重大突破。在这方面，美国的环球石油(UOP)公司以氧化铝为载体，德国Miles公司以二氧化硅为载体，制备固定化酶都取得了显著的成效。日本学者也采用了一种新型的商品名为(TNM)的无机多孔陶瓷载体来固定假单胞菌的脂肪酶。固定化细胞用于啤酒生产中的应用在我国基本上还停留在实验阶段，这主要是因为载体一般都用海藻酸盐、卡拉胶等有机材料，存在固定化工艺复杂、耐腐蚀性差、易受压变形和无法再生等缺点。浙江大学程江峰等选用了陶瓷拉西环为载体材料，在填充床反应器中进啤酒连续快速发酵反应，取得了良好的效果。2 .2.3 复合载体材料 复合载体材料是以有机材料和无机材料复合组成的新载体料。如磁性高分子微球，这是一种内部含有磁性金属或金属氧化的超细粉末，从而具有磁响应性的高分子微球。 3固定化酶的方法3.1固定化酶的传统制定方法 酶的传统固定方法主要有吸附法、包埋法、共价键合法和一些其他方法，针对不同的酶、不同的载体，需要采用不同的方法，有时还需要将几种方法联合使用5。3.1.1吸附法吸附法是通过非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶吸附在炭、有机聚合物、玻璃、无机盐、金属氧化物或硅胶等材料上。该方法又分为物理吸附法和离子吸附法。此法简便，且酶变性的可能性较小。但是在酶和载体结合具有弱键的本质，在使用过程中易解吸，又由于载体具有非特异性吸附剂的本质，因此可能同时吸附除酶以外的其他物质。3.1.2包埋法包埋法是指酶或细胞包埋在各种多种载体(如聚丙烯酰胺凝胶、矽酸盐凝胶、藻酸盐、角叉菜聚糖等)中发生聚合、沉淀或凝胶化使之固定的方法。主要分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法，该方法操作简单，酶活回收率较高，但发生化学反应时，酶易失活，适用于小分子底物和产物的酶。最近有人用聚丙烯酰胺作包埋载体， 将SOD固定化，并取得了很好的进展。3.1.3 结合法结合法指选择适宜的载体，使通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法。包括离子键结合法和共价键结合法。离子键结合法操作简单，条件温和，酶活性损失少，但酶与载体结合力弱，酶易脱落，这也是最常用的方法之一。共价键结合法研究较为成熟，酶与载体结合牢固，一般不轻易脱落，但反应条件较剧烈，会引起酶蛋白空间构象的变化，破坏酶的活性部位。在共价键结合法常用的载体有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。其中用甲壳素做载体在各个方面都得以应用。3.1.4交联法交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，是酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键，得到三向德交联网状结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在一定的分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同，还能够产生不同物理性质的固定化酶。此法反应条件较剧烈，酶活回收率很低，故不常用。一般将吸附法和交联法2种方法结合起来使用。3.2改进酶的固定化进展传统的固定方法有许多不足之处，为了实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失，有关专家进行了大量研究，或研发新型固定方法， 或改进影响固定化因素(例如载体)，都取得了不错的效果6。 3.2.1定向固定 定向固定化酶技术将成为今后固定化酶研究的热点，它解决了传统酶固定化方法中酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴露，而且酶的固定化量降低等问题。例如，为了消除因扩散而导致的胰凝乳蛋白酶对白水解的动力学限制 ，Zuzana等用高碘酸钠活化半乳糖氧化酶的糖链，并通过活化的糖链将半乳糖氧化酶定向固定。由于大分子底物容易接近酶的活性位点，因而催化动力学参数得到了改善。 3.2.2多酶共固 为了充分发挥不同酶的各自优势，把不同来酶与整个细胞的生物催化性能相结合，实现多酶或整个细胞的固定化，日益受到研究者的重视。例如：Pal等将葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶固定于乳胶膜，并将此膜用作生态友好酶乳胶膜反应器。Sat用聚乙烯亚胺的氨基彻底覆盖多孔乙醛酸琼脂表面的醛基，并以此为载体进行环己酮单加氧酶 (CHMO) 和葡萄糖一6一磷酸脱氢酶(G一6一PDH) 共价共固的研究。 3.2.3利用光、辐射等技术 通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可制备高活性固定化酶7。例如： (1) 辐射 Mohy等以Cs为辐射源，通过广射线引发将甲基丙烯酸甲酯接枝共聚于尼龙膜表面，经进一步活化，用于青霉素酰化酶的固定。 (2) 光光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于条件温和。可获得酶活力较高的固定化酶。Li等利用含芳香叠氮基的光活性酯，在远紫外光辐照下，叠氮基光解生成氮烯与PES膜表面的 CH键间发生插入反应形成仲胺，将脲酶共价键合到PES膜的表面。 (3) 等离子 等离子体是高度激发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体，大量的等离子体常在室