发 酵 科 技 通 讯 第40卷第1期 2011年1月 L 苯丙氨酸工业生产中采用连续发酵 因而 发酵培养基中各物质的含量对提取过程非常有 利 在对发酵液进行处理后 苯丙氨酸的提取率上 升12 由苯丙酮酸生产L 苯丙氨酸的生产工 艺 生产成本为13万元 t左右 用此法建设 500t a的L 苯丙氨酸装置 需投资3 500万元 主产品L 苯丙氨酸并副产丙酮酸 年销售总收入 可达1 3亿元 适用于中 小化肥厂利用合成氨再 生气开发生产 在原料 技术和经济上占有较大的 优势 1理化性质 L 苯丙氨酸 L Phenylalanine 简称L Phe 又 名L 苯基 氨基丙酸 为白色斜方晶系结晶粉 末 具有苦杏仁味 熔点 283 分解 自然界广泛 存在于卵 乳和动物蛋白中 含量5 6 植物性 蛋白质中约含1 L 苯丙氨酸可溶于水 在水中的溶解度为 3 难溶于乙醇 乙醚 在100ml水中的溶解度为 51 4 4g 100 10g 旋光度一34 5 25 苯丙 氨酸有外消旋DL 型 L型和D型 其中最重要的 是L 苯丙氨酸 2工艺开发 L 苯丙氨酸是人体的必需氨基酸 人体本身 无法合成 只能由植物和微生物合成 L 苯丙氨 酸合成的起始物为五碳糖磷酸途径的中间产物赤 藓糖 4 磷酸 erythrose 4 phosphate FAP 和糖酵 解 过 程 的 中 间 产 物 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 phophoenolpyruvate PEP 二者缩合形成一个七碳 酮糖开链磷酸化合物称为3 脱氧 阿拉伯庚酮 糖酸 7 磷酸 3 Deoxy O arobinoheptu losonate 7 phosphate DAHP 然后DAHP转化为莽草酸 SHIK 然后再转化为分支酸 CHA 由分支酸合 成苯丙酮酸 PPY 最后苯丙酮酸经转氨作用生成 L 苯丙氨酸 L 苯丙氨酸的制备方法有发酵法 酶法与化 学合成法 用化学合成法经拆分可制得L 苯丙氨 酸 国内生产厂家主要采用发酵法 2 1一步法 化学合成法路线长 副产物多 且产物为光学 消旋体 需进行光学拆分 成本高 改进工艺为一 步法 一步法合成氨基酸的技术是一项既有效又不 污染环境的合成胺和氨基酸的方法 此法可同时 将氨基酸的三个成分即氨基 羧基和侧链结合在 一起 与传统合成法相比 这是一个重大的改进 因传统方法一次只能连结上一种基团 传统合成 法既慢 费用也很高 因为前一步合成的中间体必 须加以保护 以防止下一步反应被破坏 和其他多 成分合成法也不同 利用硼化合物反应剂 只产生 一种反应副产物 硼酸 此法适合工业上采用 反 应可在室温下进行 氨基酸容易从溶液中沉淀出 来 分离简便 此法还可用于生产手性化合物 并 很适合发展相关的组合化学技术 即大批制造上 万种不同取代基的化合物 然后从中筛选出可用 作医药的化合物 一步法合成氨基酸的反应是从以往各种合成 法的研究中开发出来的 它是一种采用过渡金属 配位体催化剂 通过Wakamamu反应 把醛 酰 胺 CO三组分进行合成的胺基羧基化反应 由于 是将多步反应并为一步完成 由此大大地缩减了 反应程序与整个系统反应的投资 2 2提取法 此法是使脱脂大豆在盐酸存在下水解 除去 酸性氨基酸后 再用树脂吸附苯丙酮酸和酪氨酸 L 苯丙氨酸生产与应用 汪多仁 中国石油吉林石化公司吉林132101 29 发 酵 科 技 通 讯 第40卷 用溶剂将苯丙氨酸溶出 利用溶剂差从氨基酸中 分出 提取方法很多 主要有锌盐沉淀法 等电点中 和法 有机溶剂萃取法 活性炭吸附提取以及离子 交换法 在这些方法中 最为重要的是离子交换 法 离子交换法所用的离子交换树脂为高分子产 品 在分子结构中高分子聚合物骨架十分稳定 可 逆交换反应在树脂上可以反复进行 使用寿命长 因此离子交换法是一种目前较为普遍的氨基酸提 取方法 可以选用阳离子型离子交换树脂对体系 中的L 苯丙氨酸进行吸附提取 2 3甘氨酸法 甘氨酸法需要先对甘氨酸的羧基和氨基进行 保护 生成苯亚甲氨基乙酸乙酯 再利用 亚甲 基的氢原子的活泼性 使之在相转移条件下进行 烷基化反应 最后 经水解反应 制得DL 苯丙氨 酸 该法反应条件温和 原料易得 收率较高 无剧 毒原料 无难以处理的三废问题 所用的有机溶剂 可以回收 是一条很有发展前途的化学合成方法 2 4发酵法 20世纪60年代日本中山公司用糖质发酵制 苯丙氨酸获得成功 并由协合发酵公司实现了工 业化生产 20世纪70年代用糖质发酵的发酵液 苯丙氨酸浓度可达42 6 用苯丙酮酸为原料 经发酵法制得的工艺是 首先用氯化苄与CO合成苯丙酮酸 再使L 天冬 氨酸与苯丙酮酸在固定床反应器内用固定化细胞 提取 进行离子交换 提浓得产品 选用的菌株能 使L 苯丙氨酸的转化率不小于90 用甲醇 乙醇与乙酸为原料 用乳糖发酵短杆 菌AJC2140 使发酵液中L 苯丙氨酸含量达20g l 用裂解烃棒状杆菌及碳12 14正构烷烃发酵生 产L 苯丙氨酸 含量可达到4 5g l 使用酵母菌生产L 苯丙氨酸从天然环境中 分离到一株具有较高苯丙氨酸氨解酶 PAL 活性 的菌株 以此为出发菌株进行UV和EMS诱变处 理 所得菌株较原菌株酶活力有较大提高 且该菌 在中试中生长良好 累计产量达58 0g l 种粘红酵母 用粘红酵母生产L 苯丙氨酸解 氨酶最佳发酵条件为 起始pH值为5 5 接种量 10 温度28 发酵周期20h 终点pH值为8 0 使用杆菌生产L 苯丙氨酸由短杆菌变异株 FMP92814出发对其产苯丙氨酸条件进行了优 化 通过人工诱变选育所获得的乳糖发酵短杆菌 FMP92814可利用较粗放的农副产品 淀粉水解 糖 玉米糖浆 豆饼粉水解液 糖蜜 作原料发酵生 产苯丙氨酸 可以降低生产成本 适合目前各氨基 酸发酵厂推广 使用假单胞菌生产L 苯丙氨酸 将从土壤中 筛选假单胞菌 PseudomonassP E4 106株细胞进 行了L 苯丙氨酸生产实验 转氨反应最适温度3 5 40 在pH值为7 10内催化反应而活力变 化不大 表面活性剂处理细胞或在反应液中加入 Mg2 能显著提高转氨反应速度 在此反应体系中 E4 106菌 株 单 位 湿 重 细 胞 的 转 氨 酶 活 力 为 1039U g 当产物L 苯丙氨酸质量浓度为32 2g l 和50 3g l时 苯丙酮酸摩尔转化率分别为97 5 和87 2 产物回收率为81 8 直接发酵法较其他方法生产成本低30 以 P dacunhae发酵培养 以培养液作为酶源 直接添 加固体L 天冬氨酸可以实现酶转化 具体工艺过程是将P dacunhae菌种用表面 活性剂处理后装入瓶内进行摇瓶种子培养后再移 入发酵罐内 通入无菌空气使酶液进行生化酶反 应后再经过滤得粗品 再经后处理得产品 发酵法技术的关键是产物的分离 传统方法 使用离子交换法 但在分离前必须对发酵液进行 预处理 因此耗资较高 溶剂萃取法则要求溶剂的预再生 由此可供 选择的溶剂少 加之生成产物成分较复杂 也使萃 取法难于发挥作用 采用溶剂结晶法在加入化学 助剂后 由于操作条件苛刻 也难于进行有效的分 离 采用色层分离法由于须先经预处理 同样耗资 较大 应用电渗析法由于离子交换膜的选择性和 稳定性差 不便用于L 苯丙氨酸的分离 2 5生物工程酶法 市场上供应的L 苯丙氨酸除少量由化学法 合成外 大部分是由微生物发酵生产的 微生物合 成苯丙氨酸以糖类为碳源 首先由糖代谢中心途 径分流出来的磷酸烯醇丙酮酸 PEP 和赤鲜糖 4 磷酸 E 4 P 缩合形成脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷 酸 DAHP 然后经过一系列生化反应来完成 酶法生产具有产物浓度高 纯化步骤少 生产 能力强等优点 缺点是部分原料成本高 专家们认 为由苯甲醛斗海因斗苯丙酮酸斗苯丙氨酸或由苯 30 发 酵 科 技 通 讯 第40卷第1期 2011年1月 甲醛斗肉桂酸斗苯丙氨酸的路线是最佳方案 一酶一酸法是以海因为原料苯丙酮酸酶法 该体系最佳条件为 EA 1和EP8 10两种细胞质 量比为0 6 1 n PPA n Pu 1 1 2 摩尔比 当 PPA浓度为0 24mol l时 反应6h 可生成38 5g lL 苯丙氨酸 用转氨基酶反应生产L 苯丙氨酸 选用Cit robactorfreuindii为最好的产生此酶的菌株 此菌 株细胞可有效地由丙酮酸和供作氨基授体的氨基 酸生产L 苯丙氨酸 当使用L 谷氨酸为氨基授 体时 在保温24h时为89mg ml 由L 苯丙酮酸 生成L 苯丙氨酸的转化率为50 80 在使用 L 天门冬氨酸为氨基授体时 尽管L 苯丙氨酸的 生成速率较低 但转化率可达到80 100 当用丙酮酸转变为PEP 磷酸烯醇丙酮酸 时 在这种情况下几乎达到最大理论产量86 mol mol 微生物细胞法转化生产L 苯丙氨酸有三种 方法 一是以苯丙酮酸为基础原料 利用转氨酶转 化法 二是以酰基转移酶将乙酰氨基肉桂酸转化 成L 苯丙氨酸 三是利用苯丙氨酸解氨酶 将反 式肉桂酸转化成L 苯丙氨酸 苯丙氨酸的生物合成因素包括 宿主菌及载 体的选择 加速限速反应 改变代谢流 生产工序 对以上几个方面的优化能有效提高苯丙氨酸产 量 应用于工业化生产 在选择宿主菌及载体时 需考虑克隆载体和克隆的可能性 质粒转移及重 组的可能性 中间产物的获得 应用原料的范围 宿主生理学和遗传背景及对环境的污染等 与苯丙氨酸生物合成有关的关键酶有DAHP 合成酶 分支酸变位酶 预苯酸脱水酶 氨基转移 酶 苯丙氨酸生物合成途径分为共同途径和分支 途径 共同途径为分支途径提供前体物质 因为合 成一分子的分枝酸需两分子的PEP 所以PEP的 供应量多少决定了其生物合成 而PEP又是PEP 羧化酶 丙酮酸激酶和糖 磷酸基转移酶的竞争 性底物 包括氨基酸在内的几乎整个发酵工业中 被广泛应用 它一方面可解除底物抑制 产物反馈 抑制和葡萄糖分解阻遏效应 另一方面可避免因 一次性投糖过高造成的细胞大量生长耗氧过多 同时还不会产生菌种老化和变异 终产物浓度大 且易于分离 培养条件 通氧量及如何保持培养基 最适pH值的稳定性等在氨基酸发酵中都具有重 要作用 方法1将菌种接入基础发酵培养基作不同发 酵时间的摇床培养 从接种后24h 96h为无名球 拟酵母的对数生长期 96 120h为稳定期 120 168h为衰亡期 麦角固醇在24 96h内已有合成 随着培养时间的延长含量逐渐增加 尤其是在 72 96h 增长辐度较大 96h达到最高峰 麦角固醇酸合成主要是在菌体生长的对数期 后期 而且与菌体繁殖基本同步 其发酵周期以 96h为宜 发酵培养基为 蔗糖10 黄豆粉3 5 氮源0 75 调节pH值为5 5 分装250ml三角 瓶 灭菌后 冷却 接种 置28 振荡培养96h 测 定生物量及麦角固醇含量 其结果为生物量 4 48g 100ml 麦角固醇含量1 80 麦角固醇总 量74mg 100ml 无名球似酵母是一株优良的麦角固醇产生 菌 发酵的最佳条件为 以蔗糖和复合氮源为C N源 温度为28 pH值为5 5 装量250ml 三角 瓶装30ml 周期96h 麦角固醇产量可达74mg 100ml发酵液 由于菌体生长的条件与麦角固醇 合成的条件不一致 在菌体生长的对数期前 中 期 采用26 pH值为6 0 较大的通气量 而在 菌体生长的对数期后期至稳定期 即麦角固醇合 成阶段 升温至28 加酸降低pH值至4 5 减少 通风量 将更有利于提高麦角固醇的总产量 酶法用苯丙氨酸解氨酶可以催化生产肉桂酸 与氨 反之 用黏红酵母在含L 苯丙氨酸的培养 基内所生长的该菌体中诱导可产生苯丙氨酸解氨 酶 在培养基中加入异亮氨酸后在使酶稳定及在 最佳条件时 向反应液中加入顺式肉桂酸时生产 L 苯丙氨酸的转化率为70 方法2使用Citrobacter freuindii作为一种最 好的产生此酶的菌株 此菌株的细胞可以有效地 由丙酮酸和供作氨基授体的氨基酸生产L 苯丙 氨酸 如用L 谷氨酸作为氨基授体时 保