第2课时分离以尿素为氮源的微生物考试要求知识内容考试属性及要求考情解读分离以尿素为氮源的微生物加试1.进行微生物分离。使用含有尿素的培养基，采用涂布分离法，分离有脲酶的细菌。2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌。一、实验目的、原理、设备、用品及材料准备1.实验目的(1)使用专一的培养基(含有尿素)分离专一的细菌(有脲酶的细菌)。(2)利用指示剂颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的反应。2.实验原理(1)脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。有一些细菌含有脲酶可以分解尿素，利用尿素作为其生长的氮源。(2)(NH2)2COH2O2NH3CO23.设备及用品灭菌锅或高压锅、250 mL的三角瓶1个和100 mL的三角瓶2个、封口膜和橡皮圈、培养皿4个、接种环和玻璃刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有盖的试管(15 mm150 mm)5支和试管架、移液器。4.实验材料(1)在100 mL烧杯中装入50 mL 70%酒精，将玻璃刮刀浸泡在其中。(2)在100 mL三角瓶中配制好25 mL全营养LB固体培养基(0.25 g蛋白胨，0.12 g酵母提取物，0.25 g NaCl和0.5 g琼脂糖，水25 mL)，加上封口膜后灭菌待用。(3)在100 mL三角瓶中配制好25 mL尿素固体培养基(0.025 g葡萄糖，0.12 g NaCl,0.12 g K2HPO4,0.25 mg酚红和0.5 g琼脂糖，水15 mL)，加上封口膜后灭菌，待冷却至60 时，加入通过G6玻璃漏斗过滤(使之无菌)的10 mL尿素溶液(内含2 g脲)，摇动，混合均匀后待用。(4)将盛有4.5 mL蒸馏水的5支有塞试管灭菌后待用。(5)在250 mL三角瓶中装入99 mL蒸馏水，用封口膜盖上，灭菌后待用。(6)土样1 g(从有哺乳动物排泄物的地方取得)。1.为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？答案琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量非以尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故而用经纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂。2.分离以尿素为氮源的微生物实验所用培养基为尿素固体培养基。在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的是尿素，琼脂糖的作用是凝固剂。3.微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。据此该培养基对微生物具有选择作用，其选择机制是只有能够分泌脲酶从而以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。4.有脲酶的细菌在生态系统稳态中起什么作用？答案如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，氨与其他阴离子物质如SO、CO、NO等形成化合物，则会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。5.酸碱指示剂是用来指示反应前后的酸碱性变化的。尿素在被脲酶作用前是中性的，而作用后产生了NH3，变成了碱性，本实验使用酚红作为指示剂，在酸性情况下呈黄色，碱性情况下呈红色，变色范围是pH6.48.2。培养后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，培养基中的尿素分解产生的氨使培养基变碱性，于是酚红由黄色变成红色，这就表明以尿素为氮源的细菌分泌了脲酶并分解了尿素。圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出()A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌C.固氮细菌、霉菌、放线菌D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌答案C解析固氮细菌可以在无氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。2.下列有关叙述，不正确的是()A.脲是一种有机化合物，含有氮元素B.地表土壤中含有一定量的脲C.以尿素为氮源的细菌含有脲酶D.在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会导致培养基呈酸性答案D解析根据反应式：(NH2)2COH2O2NH3CO2，在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会产生NH3，从而导致培养基呈碱性。二、分离以尿素为氮源的微生物1.实验中的对照设置(1)实验组：以尿素固体培养基进行培养。(2)对照组：以全营养LB固体培养基进行培养。2.实验步骤制备培养基：将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基分别倒入两个培养皿中，摇匀，平放至凝固制备细菌悬液：用1 g土样配制不同浓度的细菌悬液用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，并用玻璃刮刀涂布到整个平面上培养：倒置培养皿，在37 恒温箱中培养2448 h观察：培养基中菌落数阅读教材，回答问题：1.实验原理(1)以尿素为氮源的微生物含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。(2)尿素固体培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源生长繁殖，缺乏脲酶的微生物则由于不能分解尿素而不能生长繁殖，所以，用该培养基能够筛选分离出以尿素为氮源的微生物。(3)脲酶可使尿素分解产生氨，从而可使加入酚红指示剂的尿素固体培养基变红。2.实验步骤(1)在60 左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。(2)制备细菌悬液(过程如图1)。在无菌条件下，将1 g土样加到有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡10 min，即成102土壤稀释液。依此法制备103、104和105土壤稀释液。取样时，尽量只取悬液。摇匀，放在试管架上。(3)用涂布分离法分离细菌(如图2)。取104和105的土壤稀释液各0.1 mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。(4)将培养皿倒置，在37 恒温箱中培养2448 h。观察菌落数。3.观察结果(如图3)全营养培养基中有较多的菌落，而尿素为氮源的培养基平板中只有少量菌落。4.思考与讨论(1)样品为什么要进行稀释？有什么标准？答案样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。稀释的标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30300，便于计数。(2)有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？答案细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨水为碱性，酚红在酸性环境中为黄色，在碱性环境中变为红色。培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源，红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。(3)与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？答案这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有极少数。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，每人每天排泄约500800 mL尿，但随地便溺的不多，动物虽然随地便溺，但尿素还是可以在高温下自然分解的。因此，以尿素为氮源的菌群较少。(4)2013年11月22日凌晨3点，青岛黄岛区发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？答案配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。5.微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用对照组作用现象结论未接种培养基有无杂菌污染的判断未接种的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染接种的牛肉膏蛋白胨培养基选择培养基筛选作用的确认牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用3.现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如下图所示：请回答：(1)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，将土壤用 进行一系列的梯度稀释，同一浓度的土壤稀释液应至少涂布 个平板，通常以每个培养皿中有 个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。(2)接种后的培养皿 于37 的恒温箱中培养。若培养基中存在含脲酶的细菌，其菌落周围会出现 ，这是由于尿素被分解产生氨气，与该培养基中的 产生的颜色变化，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。(3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基成分上最主要的特点是 。(4)下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的是(多选)()A.称取葡萄糖、琼脂糖等培养基成分B.倒平板C.涂布平板D.微生物的培养(5)与LB全营养培养基上的菌落数相比，尿素培养基上只有少数菌落的原因是 。答案(1)无菌水320(2)倒置红色环带酚红指示剂(3)以尿素作为唯一氮源(4)BC(5)土壤中能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量解析(1)涂布分离法必须先用无菌水对土样进行一系列的梯度稀释，通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。(2)接种后需倒置培养皿恒温培养。含有脲酶的细菌能够将尿素分解，产生的氨气使培养基呈碱性，导致培养基中的酚红指示剂呈红色。(3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基应以尿素为唯一氮源。(4)进行微生物培养和分离时，倒平板、涂布平板均需要在酒精灯火焰旁进行，以防杂菌污染。(5)尿素培养基只以尿素为氮源，在尿素培养基上生长繁殖的只能是少数能够合成脲酶可利用尿素的细菌。4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是()A.将土壤用无菌水稀释，制备103105土壤稀释液B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上C.用加入酚红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株答案C解析从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液；将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上；用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌；从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。一题多变判断正误：(1)(NH2)2COH2O2NH3CO2()(2)尿素固体培养基配制后需要在121 (1 kg/cm2压力)下灭菌15 min()(3)本实验中的LB培养基和尿素培养基均为固体培养基()(4)接种后，应将培养皿正置，在37 恒温箱中培养2448 h()(5)