Sebia全自动凝胶电泳仪临床应用 襄阳市中心医院 1 使用范围和检测原理 电泳技术就是利用在电场的作用下 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小 形状等性质的差异 使带电分子产生不同的迁移速度 从而对样品进行分离 鉴定或提纯的技术 在生化检测中 主要用于分离各类蛋白分子 2 发展历程 1809年俄国科学家列伊斯首先发现电泳现象1937年瑞典科学家Tiselius建立了界面电泳技术 并首次证明了血清是由白蛋白及 球蛋白组成的因此获得1948年诺贝尔化学奖 1950年后 区带电泳从发展到成熟 1980年以来 毛细管电泳逐渐受到重视 3 常用的电泳技术 滤纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶适用于蛋白质和核酸的电泳支持介质 成本低 结果易保存 聚丙烯酰胺凝胶电泳 最常用的定性分析蛋白质的电泳方法 特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量 一般用于科研 毛细管电泳 经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物 4 血清蛋白电泳免疫固定电泳非浓缩尿蛋白电泳 5 血清蛋白电泳 6 法国SEBIA凝胶电泳 琼脂糖凝胶介质 分子筛效应 分辨率高不吸附蛋白质 阻力小 分离清晰 透明度高PH8 8碱性环境根据蛋白质所带电荷的多少和蛋白分子的大小及形状分离不同的蛋白成分按泳动速度分成5个区带 每个区带含1种或更多种的蛋白成分 7 30人份琼脂糖凝胶片血清蛋白电泳 8 正常血清蛋白电泳图谱 9 血清蛋白电泳的正常参考值 10 各区带构成 Alb 白蛋白 1 1酸性糖蛋白 1抗胰蛋白酶 1脂蛋白 甲胎蛋白 2 HP 2巨球蛋白 脂蛋白 CER 转铁蛋白 补体系统 脂蛋白纤维蛋白原 2微球蛋白 IgG IgM IgA IgD IgECRP 11 血清蛋白电泳可以帮助我们精确地描绘出患者血清蛋白质的全貌 是生化仪测定蛋白质的完善和补充可以提示是哪一种球蛋白异常 便于临床有的放矢的进一步检查 节省患者费用 12 对单一克隆浆细胞异常增殖产生M蛋白的检测 血清蛋白电泳是其首选的实验诊断方法 由于MM髓外病灶在肝 脾 淋巴结多见 故认为肝功能异常患者应进行血清蛋白电泳检测作为筛选可帮助对一些遗传性疾病作出诊断 如 双白蛋白血症 1抗胰蛋白酶缺陷 蛋白电泳呈现特征性图谱 13 血清蛋白电泳中发现的与急性时相反应蛋白相关的疾病 Alb 脱水 慢性消耗性疾病 慢性炎症 出血 烧伤 蛋白丢失 肠病 因白蛋白减低而引起的肝脏功能下降 营养失调 肾病综合征 妊娠 1 妊娠 低抗胰蛋白酶血症 2 肾上腺不足 肾上腺皮质类固醇治疗 糖尿病 肾病综合征 营养不良 巨红细胞性贫血 蛋白丢失的肠病 严重肝病 Wilson s病 胆汁硬化 癌症 有时 Cushing s病 糖尿病 某些病例 甲状腺机能减退 缺铁性贫血 恶性高血压 肾病 多动脉炎 阻塞性黄疸 妊娠 营养不良 淀粉样变性 慢性感染 慢性淋巴细胞白血病 硬化 Hodgkin s疾病 恶性淋巴瘤 多发性骨髓瘤 结缔组织病 巨细胞血症 血中丙种球蛋白缺乏 低丙种球蛋白症 14 球蛋白区域的变化在肝病的临床意义 1球蛋白在肝炎初期 作为急性期反应物质常增加 而肝损害严重时则降低 在致命的肝功能衰竭时可以降低到很低的水平 15 球蛋白区域的变化在肝病的临床意义 2球蛋白的降低可能由于结合珠蛋白合成降低所致 但在胆汁淤积性肝炎时由于 2脂蛋白增加可见到 2球蛋白部位增加 当亚急性肝炎和肝坏死时 2球蛋白则明显减少 故 2球蛋白的变化可作为肝障碍时的特征性指标 如明显下降 提示预后不良 16 球蛋白区域的变化在肝病的临床意义 球蛋白在肝炎早期几乎没有变化 但由于此组分也有脂蛋白 胆汁淤积性肝炎时与 2球蛋白一样 多数明显升高 当肝细胞损害严重时 由于肝脏合成减少则明显降低 17 球蛋白区域的变化在肝病的临床意义 几乎所有肝脏疾病 球蛋白均升高 且呈多株性的 其增加的范围与疾病的严重程度相一致 若转为慢性可见 球蛋白明显增高这是由于免疫球蛋白合成亢进所致 18 血清蛋白电泳图谱在肝脏疾病的变化 T PROTAlb 1 2 肝炎 N 肝硬化 N N N 桥肝癌 N 甲胎蛋白N N N 19 20 血清蛋白电泳图谱在肾病的改变 Alb明显降低 1 球蛋白轻度增加 2 球蛋白明显增加 球蛋白降低 正常 增高 球蛋白降低 正常小儿类脂样肾病时 球蛋白可降低 有时可降低至零成人肾病综合症时 球蛋白通常增加 特别是狼疮性肾病 21 22 23 24 25 26 肾病综合征 27 急性感染综合征 28 先天性白蛋白缺乏症 29 双白蛋白血症 30 1抗胰蛋白酶缺乏症 31 贫血之高转铁蛋白 32 免疫球蛋白增高 33 血清蛋白电泳是M蛋白 MonoclonalProtein 多克隆 polyclonalProtein 寡克隆 OligoclonalProtein 的首选检测项目 34 M蛋白疾病 Monoclonalgammap athies MG 是由于单一克隆浆细胞无限增殖产生的均一单克隆蛋白 Monoclonal proteins 所导致的一组疾病 M蛋白疾病的 M 含义是Myeloma Macroglobulinemia和Malignantlymphoma MonoclonalGammapathies均以 M 开头 M蛋白在电泳上表现为高而狭窄的尖峰 高 宽 2 1 35 多发性骨髓瘤的临床特征 骨质疏松和溶骨现象贫血 粒细胞 血小板减少肾淀粉样变性损害免疫功能低下 易感增加 36 多发性骨髓瘤的免疫学特征 血中出现M蛋白 正常Ig水平明显减低尿中出现M蛋白和轻链蛋白 BJP 骨髓中浆细胞明显增加无免疫活性Ig导致免疫功能低下 37 巨球蛋白血症 Waldenstrom氏 患者血中存在大量单克隆IgM 血粘度明显增多 骨骼损害不常见 疾病发展类似淋巴瘤 38 轻链病 轻链病多表现为肾脏损害 极易误诊为慢性肾炎 我们认为轻链有3种形式出现在血清或尿中 一是正常的轻链过剩 Kappa和Lambda同时出现 多出现于慢性肝病 SLE等多克隆增殖中 二是伴随轻链 三是单一轻链 血和尿中只出现单一增殖的大量轻链 39 重链病 由于制造Ig的浆细胞发生突变 并恶性增殖 只产生重链或产生的重链有缺陷 因而轻链和重链不能组成完整的Ig 血中出现大量无免疫功能的Ig片段 重链 由此产生一系列重链病变 重链病是免疫蛋白的结构异常所致 常见三型 该病发病率极低 40 M蛋白电泳图谱 M蛋白是单克隆性浆细胞或淋巴细胞大量增殖而产生的一种在氨基酸组成基排列顺序上十分均一的异常球蛋白 其本质是免疫球蛋白或其片断M蛋白在 2 区形成浓密区带用光度计可扫出基底较窄 高而尖锐的蛋白峰其标准为 在 区 蛋白峰的高和宽之比应 2 1 在 区和 2区应 1 1 41 42 43 44 位于 区的单克隆IgA 45 单克隆带 46 寡克隆图案 47 轻链病 48 老年性单克隆带 49 位于 2区单克隆带 50 多发性骨髓瘤的误诊原因分析 51 52 53 多发性骨髓瘤诊断标准 1 骨髓中浆细胞 15 并有异常浆细胞 骨髓瘤细胞 或骨髓活检为浆细胞瘤 为主要的诊断依据 2 血清中出现大量单克隆免疫球蛋白 M蛋白 IgG 35g L IgA 20g L IgD 2 0g L IgE 2 0g L IgM 15g L或尿中出现单克隆免疫球蛋白轻链 轻链排出 1g 24小时 3 无其他原因的溶骨病变或广泛性骨质疏松 54 免疫固定电泳对M蛋白的分型与鉴定已作为实验室常规工作 55 将待测血清或其他标本在琼脂平板上作区带电泳 分离后于其上覆盖含抗 或 轻链或各类重链的抗血清滤纸 当抗体与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合后 便形成复合物而沉淀下来 再通过漂洗与染色 呈现浓而狭窄的着色区带 即可判断单克隆丙种球蛋白的轻链和重链型别 56 4人份琼脂糖凝胶固定免疫电泳 57 正常血浆免疫固定电泳 58 IgM重链及 轻链 59 轻链型IgG并其他Ig缺乏 60 轻链型IgA并其他Ig缺乏 61 寡克隆带 62 移植病人之寡克隆带 63 艾滋病人之寡克隆带 64 游离 轻链 65 Electrophoreticexplorationofproteinuria 非浓缩尿蛋白电泳临床应用 66 肾单位生理及与血浆蛋白质关系 肾脏近二百万个肾单位每天过滤1600升血液并产生180升原尿 经肾小管重吸收后最终排出约1 5升终尿 白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白微蛋白 白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白 微蛋白 肾小球滤过膜 肾小管重吸收 微蛋白 肾小管分泌 Thamm Horsfall蛋白 终尿中白蛋白占1 3 球蛋白占2 3 67 尿蛋白定义 生理性尿蛋白为50 150毫克 天 大约100毫克 升以下 主要成分为白蛋白 30毫克 天以下 病理性尿蛋白为超过1 0毫克 天蛋白质成分复杂多样 68 尿蛋白增加的原因 生理性 间歇性 体位 高蛋白饮食 剧烈运动后 精神压力大 肾前性 高血压 高热 心脏或肝脏衰竭 血中蛋白浓度过高 溢出性蛋白尿 肾性 肾小球或肾小管损害 或两着均有 肾后性 泌尿生殖道损害 69 十二烷基磺酸钠 琼脂糖凝胶电泳 SDS AGE 技术的分析原理 SDS SodiumDodecysulphate 是一种阴离子型表面活性剂 当其浓度达蛋白质的5 10倍时 与还原剂共同作用 能使蛋白质分子内的氢建和二硫键断裂 解离成单独的亚基与SDS充分结合形成带负电荷的亚基 SDS胶束 所带电荷量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量 从而消除了不同分子之间的原有电荷差异 根据流体动力学的研究证明 这种复合物是椭圆形 短轴约为1 8A 但长轴的长度与亚基分子量的大小呈正比 加之琼脂胶的分子筛作用 使电泳的迁移率与摩擦系数的反比关系只表现在蛋白质分子量大小上 因此尿蛋白各组分便可按分子量的大小顺序排列在琼脂糖凝胶上 70 70kDa 70kDa 肾单位生理结构 肾小球滤过膜 肾小管重吸收 SDS agarosegelelectrophoresis十二烷基磺酸钠 SDS SDS 71 尿蛋白电泳以分子量排列原理 SDS SDS 分子量标记 kDa 14 4 30 43 67 94 低分子量 70kDa 高分子量 70kDa 白蛋白 72 Hydragel尿蛋白电泳结果解释 分子量标记 kDa 14 4 30 43 67 94 白蛋白 肾小管标记 肾小球标记 73 Hydragel尿蛋白电泳 溶菌酶 视黄醇结合蛋白 轻链 白蛋白 转铁蛋白 免疫球蛋白 2 微球蛋白 微球蛋白 Ser Ser PM Ser Ser 74 肾小球滤过功能 低分子量蛋白质 小于70kDa 可被滤过 其他影响每种蛋白质滤过的因数 形状 所带电荷 血浆浓度 滤过取决于肾动力参数 肾小球滤过膜的损害可导致大分子量的蛋白质 超过70kDa 漏出 75 肾小球性蛋白尿产生原因 主要是肾小球受到炎症 毒素等的损害 引起肾小球毛细血管壁通透性增加 滤出较多的血浆蛋白 超过了肾小管重吸收能力所形成的蛋白尿 频发于成人及婴幼儿 一般尿蛋白总量常大于1000mg 天 常见于肾小球疾病如急性肾小球肾炎 某些继发性肾脏病变如糖尿病肾病 免疫复合物病如红斑狼疮性肾病等 76 肾小球损害 70kDa 70kDa 白蛋白 70kDa 70kDa Ser 77 电泳图谱表现 表现为漏出性蛋白尿 出现白蛋白及分子量更大的转铁蛋白 免疫球蛋白 有时甚至出现 2 巨球蛋白 分子量越大损伤越严重 这里可以初步估计出蛋白尿的选择性 作为判断肾小球损伤严重程度及肾小球病变预后评价的一个重要指标 78 肾小管重吸收 肾小管可重吸收被肾小球滤出的低分子量蛋白质 70kDa activeendocytosis 99 被肾小球滤出的蛋白质可被肾小管重吸收 例如 白蛋白每天可被滤出18g 但在生理性终末尿中仅30mg 天 肾小管损害可减弱对低分子量蛋白质 70kDa 的重吸收 当血浆浓度增加超过肾小管重吸收阈值时 亦可出现低分子量蛋白质 79 肾小管性蛋白尿产生原因