防腐剂测定方法的研究 青岛市药品检验所二00八年10月 课题来源根据国家药典综发 2008 55号文及第九届药典委员会微生物专业委员会第一次会议要求 由青岛所牵头拟定了 防腐剂效力测定方法的研究 课题实验方案 参加单位有上海市食品药品检验所 天津市药品检验所 深圳市药品检验所 自2008年开展了工作至2008年10月完成了课题全部工作 课题对8个剂型27批供试品 进行了生长环境 培养基 培养温度 培养时间 等试验通过试验确立了正确的 科学的 简便易行的检验方法 1 供试品分类 根据药品给药途径及用途分类 2 试验使用材料 培养基 阳性菌株 稀释液 3 检验方法 检验方法包括 方法 培养环境 检出率 鉴别方法 典型性 等 一 研究目的 如果药物本身不含有充分的抗菌力 在正常储存和使用过程中可能发生细菌污染和大量繁殖 对患者引起污染或造成药物变质 在生产过程中添加适合的防腐剂以保证药品的质量 所有防腐剂都具有一定的毒性 而且在贮存过程中其有效性有可能因药物的活性成分提高或降低 为保证药品的质量和用药安全 添加防腐剂的量应根据制剂本身是否具抗菌活性 保持最低有效量 防腐剂效力的测定可为生产过程中添加防腐剂提供指导 随着科学发展 新型防腐剂大量出现 防腐剂效力的测定更为重要 使生产者正确掌握产品中添加防腐剂的效力 有助于选择合适的防腐剂 也可对防腐剂使用的正确性给予评价 二 目前国内外防腐剂效力测定的现状 目前欧洲 美国 英国等国药典均已在附录中收载了防腐剂效力测定 虽然方法不同 但均采用了生物测定方法 我国药典防腐剂效力测定目前还是空白 有必要经过研究 制订出科学 简便 易行的测试方法收载于药典附录中 防腐剂效力的测定 不但为生产者提供正确的使用防腐剂的指导 而且可对使用防腐剂的正确性给予评价 三 研究目标 确立正确的 科学的 简便易行的检验方法 1 供试品分类 根据药品给药途径及用途分类 2 试验使用材料 培养基 阳性菌株 稀释液 3 检验方法 检验方法包括 方法 培养环境 检出率 鉴别方法 典型性 等 防腐剂效力测定试验方法的研究总结报告 按课题试验方案要求 根据药品的剂型和给药途径对8个剂型27批供试品 新型防腐剂 作为对照品 针剂 不含防腐剂 口服液 混悬剂 阴道用药 滴耳剂 滴眼剂 抗酸剂 在供试品中接种定量活菌 采用经验证的检验方法 在指定的时间间隔下 测定活菌数 根据测得的活菌对数值变化 判断该产品添加的防腐剂的有效性 1 试验的材料供试品 对照波斯特新型防腐剂其有效成分是聚氧烯烃基胍 取本品0 51ml加入1001ml蒸馏水中 制成每1ml含50PPM的溶液 作为试验对照品 阴性对照 不含防腐剂 氯化钠注射液 碳酸氢钠注射液 颠茄口服液供试品 含防腐剂 抗病毒口服液 呋麻滴鼻液 硫糖铝混悬液 阿昔洛韦滴眼液 鲸脂滴耳液 洁而阴洗液 培养基大豆酪蛋白肉汤琼脂培养基大豆酪蛋白肉汤培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基改良马丁琼脂培养基稀释液PH7 0氯化钠 蛋白胨缓冲液 菌种对试验用菌种的要求同 中国药典2005版 附录XJ细菌 霉菌及酵母菌计数 所用菌株传代次数均为第3代 铜绿假单胞菌 CMCC B 10104 金黄色葡萄球菌 CMCC B 26003 白色念球菌 CMCC F 98001 黑曲霉 CMCC F 98003 大肠埃希菌 CMCC B 44102 菌液制备同 中国药典2005版 附录XJ细菌 霉菌及酵母菌计数 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌制成每1ml含菌数为108cfu的菌悬液 黑曲霉制成每1ml含孢子数108cfu的孢子悬液 菌液稀释先用比浊管比浊 再用平板法确定含菌浓度cfu ml 试验方法 供试液的制备 在无菌条件下进行 取供试品20ml g 5份 分别加入5个带盖的试管中 抗酸剂加入上述制备的5种菌液0 1ml 约含103 104cfu 其余分别加入菌液0 1ml 约含105 106cfu 摇匀 供试品的分类为了实验结果的判断 根据供试品的给药途径和用途 将被测试的供试品分为四类 见表1 放置 将上述接种后供试液 摇匀 立即取样检测 剩余供试液 置室内20 25 阴凉处保存 时间 分别在0 6h 24h 72h 7d 14d 21d 28d按下述方法测定存活的细菌数 供试品中加入试验菌立即进行试验为0时 方法 采用经验证的试验方法 验证方法同 中国药典2005版 附录XIJ细菌 霉菌及酵母菌计数验证方法 结果见表1铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌接种大豆 酪蛋白琼脂培养基 于30 35 培养18 24小时 白色念球菌接种沙氏葡萄糖琼脂培养基 于20 25 培养24 48小时 黑曲霉接种改良马丁琼脂培养基平板上 于20 25 培养5 7天 取出计数 分别在0 6h 24h 72h7d 14d 21d 28d按下述方法测定活菌数 氯化钠注射液 碳酸氢钠注射液 颠茄口服液采用常规法进行检验 在规定时间取制备 加入菌 的供试液1ml 加入培养基 检验方法同 中国药典2005版 附录XIJ微生物限度检查 细菌 霉菌及酵母菌计数 结果见表2 抗病毒口服液 诘而阴洗液 呋麻滴鼻液 硫糖铝混悬液 阿昔洛韦滴眼液 用采用培养基稀释法 进行检验 在规定时间取制备 加入菌 的供试液0 2ml 加入培养基 检验方法同 中国药典2005版 附录XIJ微生物限度检查 细菌 霉菌及酵母菌计数 结果见表3 波斯特防腐剂 鲸脂滴耳液采用滤膜过滤法 进行检验 在规定时间取制备 加入菌 的供试液1ml 加入滤器中滤过 用PH7 0氯化钠 蛋白胨缓冲液少量多次冲洗 检验方法同 中国药典2005版 附录XIJ微生物限度检查 细菌 霉菌及酵母菌计数 结果见表3 计数 按上述方法接入试验菌后 摇匀 立即检测 此时细菌生长数量为0时结果 以后间隔6h 24h 72h 7d 14d 21d 28d 测定每个供试液每1ml g 活菌数 见表2 3计数方法同 中国药典2005版 附录XIJ细菌 霉菌及酵母菌计数 对数值 对测得的细菌数计算其对数值并计算出每个时间间隔测得的细菌数与0时测得的细菌数 初试值 的降低值 见表4 结果判断 根据接种后供试液在指定的时间间隔下测得的对数值变化 参照表5 防腐剂抗菌效力标准 进行结果判断 总结 按课题试验方案对以上8个剂型 九个供试品在指定的时间间隔下 测得的活菌数 计算活菌对数值变化 根据表5判断供试品防腐剂的有效性 一 试验方法的确立 对试验用供试品采用的方法进行了验证试验 根据试验结果 氯化钠注射液 碳酸氢钠注射液 颠茄口服液采用常规法进行检验 抗病毒口服液 诘而阴洗液 呋麻滴鼻液 硫糖铝混悬液 阿昔洛韦滴眼液 用采用了培养基稀释法进行检验 波斯特 鲸脂滴耳液采用滤膜过滤法 进行检验 验证试验5株菌回收率均在80 以上 符合 中国药典2005版 规定 二 防腐剂效力的判断 根据接种后供试液在指定的时间间隔下测得的细菌数计算其平均对数值与0时测得的细菌数 初试值 的降低值见表4 氯化钠注射液 碳酸氢钠注射液不含防腐剂加入菌从6h就开始无限增加 不具防腐力 抗病毒口服液从初始到24h对数值无变化 72h后明显降低 具一定的防腐力 呋麻滴鼻液 硫糖铝混悬液 阿昔洛韦滴眼液 鲸脂滴耳液 洁尔阴洗液从初始值到7天后计算值大于于1 0log降低量 从初始值到14天后计算值大于3 0log 具较强的防腐效力 抗病毒口服液和呋麻滴鼻液对真菌防腐效力较差7天 0log降低量大于3 0log波斯特是特效防腐剂具极强的防腐效力 72h防腐效力达100 表1方法验证 注 平均加入菌数 两次测定菌数的平均值平均检出菌数 两次测定菌数的平均值 表2供试品 含防腐剂 放置不同时间细菌计数 表3供试品 不含防腐剂 放置不同时间细菌计数 表4供试品 含防腐剂 放置不同时间细菌对数值 表5供试品 含防腐剂 放置不同时间细菌对数值 表6平均对数降低值 注 1 平均对数值 两次不同间隔时间测得的存活细菌数的对数平均值 2 初试值 0时测得的存活细菌数为初试值 3 降低值 每个间隔时间测得的存活细菌数与初试值减少的差为降低值 4 0未检出存活菌 5 测得的存活细菌数对数值超过0时测得的存活细菌数对数值 表7防腐剂抗菌效力标准 注 初始值是指试验0时细菌 真菌生长数 表7防腐剂抗菌效力标准1类供试品细菌从初始值到7天后计算值不少于1 0log降低量 从初始值到14天后计算值不少于3 0log 从第14天到第28天不增长 真菌从初始值到7 14 28天都不增长 2类供试品细菌从初始值到14天后计算值不少于2 0log降低量 从第14天到第28天不增长真菌从初始值到14 28天都不增长3类供试品细菌从初始值到14天后计算值不少于1 0log降低量 从第14天到第28天不增长真菌从初始值到14 28天都不增长4类供试品细菌 真菌从初始值14 28天都不增长注 初始值是指试验0时细菌 真菌生长数 谢谢