第四章细胞融合及其应用 第一节细胞融合概述第二节细胞融合技术应用 什么是细胞融合 为什么要进行细胞融合 简述细胞融合的研究历史 第一节细胞融合概述 一 细胞融合的概念和意义 1 概念细胞融合 cellfusion 又称体细胞杂交 somatichybridization 即在自然条件下或用人工方法 生物的 物理的 化学的 使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞或使之分化再生 形成新物种或新品种的技术 克服物种间杂交不亲和或不能受精或胚胎早期败育 为遗传物质广泛重组提供新途径 如 薯番茄 番茄薯 2 意义 3 细胞融合的类型 1978年 德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣告 他用马铃薯与番茄相结合 得到了地上部分结青色果实的 薯番茄 但地下尚未结出马铃薯的块茎 后来 美国堪萨斯州立大学的科学家 把番茄和马铃薯的细胞部分融合在一起 培育出了地上结黄色果实 地下长白色薯块的 番茄薯 据说番茄的产量很高 创造细胞质杂种 某些农艺性状如 细胞质雄性不育 除草剂抗性等都是由细胞质控制的 有性杂交中雄配子携带细胞质极少 难以产生细胞质杂种 细胞融合的杂种细胞质能够选择某一亲本的叶绿体 但线粒体可实现双亲重组 为遗传学研究提供新的手段 如 核质相互关系 基因作用与定位 肿瘤的发生等 二 基本原理 细胞融合的基本原理是什么 简述细胞融合的大致过程 1 相关概念 合胞体 synkaryon 在细胞融合过程中 开始阶段只来自两个细胞的细胞质先聚集在一起 而细胞核仍保持彼此独立 这种特定阶段的细胞结构称为合胞体 同核体 homokaryon 同核融合细胞 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体 是由同源的原生质体融合产生的 异核体 heterokaryon 异核融合细胞 来自不同基因型的细胞融合形成的杂交细胞为异核体 由非同源的原生质体融合产生的 杂种细胞 体细胞杂种 来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞核内 产生出杂种细胞 由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞 因此又叫做体细胞杂种 2 基本原理 细胞质膜的特性细胞膜融合的原理质膜靠近 质膜局部区域紧密粘连 磷脂分子重排 形成细胞桥 胞质融合 细胞核融合 3 细胞融合大致过程 植物细胞融合过程 人造小鼠培育过程示意图 三 细胞融合方法 细胞融合方法有哪些 试述其原理 1 1植物或微生物原生质体的制备1 2动物单个细胞的获得首先获得动物组织 然后经消化液消化获得单细胞 常用消化液 胰蛋白酶适于细胞间质较少的软组织 胶原酶适于消化胶原和细胞间质丰富的纤维组织 癌组织等 1 融合材料 2 融合方法 诱导融合的方法种类 离子诱导融合法 化学诱导高钙 高pH法 PEG 聚乙二醇 法 离心振荡物理诱导显微操作电融合生物法仙台病毒法 2 1化学法2 1 1离子诱导融合法 常用的盐类离子有硝酸钠 硝酸钾 硝酸钙 氯化钙等 钠离子能中和原生质体表面的负电荷 使凝聚的原生质体得质膜紧密接触 促进细胞融合 1970年 Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体进行了融合 1972年 Carlson也用硝酸钠作融合剂 获得第一个烟草种间体细胞杂交植株 该方法异核体形成频率低 0 1 4 2 1 2高钙 高pH法 首先用于人和鼠的动物细胞杂交 后来引用在植物原生质体的融合 并利用这种融合方法获得了烟草体细胞杂种 1973年 50mmol L钙离子 pH值10 5 钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性 影响原生质体膜的结合 高pH值能改变质膜的表面电荷 有利于细胞融合 该方法高pH值对原生质体有害 异种融合效率达10 35 高国楠 1974 PEG是一种多聚化合物 分子量在200 20000之间 毒性小易操作 用PEG法与高钙 高pH法结合 制备两亲本的原生质体 并至合适密度 105个 ml 将PEG溶液加入 并孵育一段时间 24 或37 10 20分钟 缓缓加入高钙高pH溶液15分钟 洗涤 收集细胞计算融合率 融合促进剂 伴刀豆球蛋白A 二甲基亚砜和链胃蛋白酶等 提高细胞的融合频率 2 1 3PEG 聚乙二醇 法 PEG含有醚键而具有负极性 与水 蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键 当PEG分子足够长时 可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连 PEG也能连接Ca2 等阳离子 Ca2 可在一些负极化基团和PEG之间形成桥 因而促进粘连 在洗涤过程中 连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱 引起电荷的紊乱和再分布 从而引起原生质体融合 高Ca2 高pH清洗增加了质膜的流动性 大大提高了融合频率 PEG诱导融合原理 蟾蜍血细胞融合实验 物理诱导融合包括离心振荡 显微操作和电融合显微操作 显微操作将大熊猫体细胞注入去核兔卵母细胞卵周隙中 2 2物理诱导融合 电融合原理 细胞处于不均一的交变电场 细胞极化成为偶极子 排列成串珠状 再施加瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿 从而导致融合 在融合仪控制下的融合小室内进行 各种指标都可精细调节控制 融合效率高 zimmermann1981 融合频率达60 优点 融合效率高 操作简单 重复性强 无毒性 可在显微镜下直接观察细胞融合过程 仙台病毒 亦称HVJ HemagglutinatingvirusofJap an的缩写 乙型副流感病毒 属副黏液病毒属 RNA病毒 M Kuroya 1953 年 日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起 并使膜产生一些断裂 两个细胞核会通过裂口融合在一起 不耐热 几乎可凝集所有种类的红血球 而且有溶血性 在鸡胚 各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖 2 3生物法 病毒法疱疹病毒 牛痘病毒和副黏液病毒 病毒囊膜上有许多刺突 spike 刺突上都是一个单价血细胞凝集素 刺突还有唾液酸苷酶的活性 水解寡糖链上的唾液酸残基 攻击细胞表面 仙台病毒 程序 紫外线将病毒灭活 稀释到一定浓度 加入到细胞悬液中 离心 诱导细胞融合 优点 融合效率高 适合于各种动物细胞 仙台病毒在鸡胚中大量繁殖 容易培养 缺点 仙台病毒不稳定 制备过程繁琐 易失活 容易对细胞产生干扰 3 1植物细胞融合 植物原生质体融合无种属特异性 融合效率只与外界条件有关 PEG诱导关键是处理时间 过长损伤原生质体 过短不融合 PEG的规格和纯度 分子量多为4000 6000 电融合 与原生质体密度有关 最适密度为2 104 8 104电融合时 加入少量CaCl2 可维持电导率 保护细胞 交变电流强弱 处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率 添加促融合剂 可提高融合率 3 影响融合的因素 3 2动物细胞融合亲本细胞表面性质影响大 表面覆盖绒毛且不规则的较容易 表面光滑的不易融合 细胞种类不同 融合效果不同 腹水癌细胞易融合 淋巴细胞或血球细胞不易融合 融合时温度和运动状态 仙台病毒诱导腹水癌细胞融合 37度 振荡 需氧量大 缺氧常不融合 需要Ca2 最适浓度为0 1mol L 最适pH值为7 4 7 8 四 杂种细胞的筛选和鉴定 一 体细胞杂种的遗传特性 1 细胞分裂与染色体丢失如果细胞分裂而核不发生融合 在以后的发育过程中就会有两种结果 一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡 二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失 如果这样就会产生几种情况 A细胞 B细胞质 A细胞 B细胞质和部分染色体或基因 2 基因转移与性状表达由于染色体的部分丢失 常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合 其结果是实现了亲本间的基因转移 基因转移通常是在后代中某些性状得以表达 有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状 3 体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定 这可能涉及到多方面的因素 如亲缘关系的远近 培养过程中的染色体变异 细胞核 细胞质遗传物质的重组等 二 融合细胞的筛选 I 植物细胞筛选方式1 遗传互补筛选法 利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因 纠正另一亲本的缺陷 令杂种细胞表现正常 如 亲本1 叶绿体缺陷型亲本2 光致死型两亲本在光照下一种死亡 另一种呈白色 融合细胞长成植株呈绿色 并能成长 2 抗性互补筛选法 利用亲本细胞原生质体对抗生素 除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞 亲本1 对放线菌素D抗性 但在MS培养基上不能超过50个世代 亲本2 对放线菌素D很敏感 但能在MS上生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长 而亲本和其它细胞死亡 3 利用物理特性筛选法 根据亲本的原生质体大小 颜色 漂浮密度及电泳迁移率 形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞 如 亲本1 异硫氰酸荧光素 FITC 标记亲本2 碱性蕊香红荧光素标记在荧光显微镜下 亲本1为绿色 亲本2为红色 杂种细胞可以区分 4 利用生长特性筛选法 利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞 例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长 但其融合细胞可以产生内源激素 在培养基上不需加激素 II 动物细胞筛选方式 1 利用抗药性筛选系统 利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞 亲本A 对氨苄青霉素敏感 对卡娜霉素不敏感亲本B 对卡娜霉素敏感 对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 2 营养互补筛选系统 细胞在缺乏一种或几种营养成分时 不能生长繁殖 即营养缺陷型细胞 利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞 亲本A 色氨酸缺陷型亲本B 苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养 而亲本细胞均会死亡 3 温度敏感突变型杂种细胞的筛选 一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长 但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长 由此筛选杂种细胞 亲本一 具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长 亲本二 高温敏感突变型 但不能抗卡娜霉素 杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长 第二节细胞融合技术应用 一 动物细胞融合和单克隆抗体制备 一 动物细胞融合研究简史 二 动物细胞融合技术主要应用 三 单克隆抗体制备二 植物原生质体融合培育新品种 一 研究简史 二 融合程序三 微生物原生质体融合构建新菌株 一 动物细胞融合和单克隆抗体制备 一 动物细胞融合研究简史生物界自发细胞融合 1838年 Muller发现分散性肿瘤细胞能自发融合产生多核细胞 后来人们发现了多种体内细胞合并现象 体外培养细胞融合 1958年 日本人冈田发现仙台病毒具有诱发艾氏癌细胞相互融合的效应 1365年 冈田等利用仙台病毒诱导两种不同动物细胞融合 产生第一个种间异核体 1978年 瑞士科学家和美国科学家将人的纤维肉瘤细胞与小鼠的畸胎瘤细胞融合 获得含人体染色体的小鼠 人畜细胞融合引发激烈争论 2000年10月 澳大利亚和美国的两家生物公司把人体细胞和猪细胞融合在一起 并向欧洲专利局申请专利 环保人士指责这些科学家是 弗兰肯斯坦式的科学家 创造怪物的人最终受到怪物的伤害 所造出的是令人恐惧的 半人半猪怪物 目前 融合技术已迅速发展到动物间 动植物间及人体细胞和动植物细胞间 狮头 羊身 蛇尾的吐火怪兽 二 动物细胞融合技术主要应用1 染色体的基因定位如 将人体细胞与小鼠细胞融合 在杂种细胞系中 优先排斥人染色体 因此 每种细胞系都仅含有一条或若干条特异性的人染色体 通过对这些细胞系生理生化功能分析 就可以断定特定的人染色体的功能 已经证明 仅保留着1号人染色体的人 小鼠杂种细胞系 才能合成人尿苷单磷酸激酶 证实编码这种激酶的人基因定位在1号染色体上 将不同人类疾病遗传缺陷的突变细胞融合 产生的杂种细胞由于基因的互补作用 可恢复其正常的表型 应用基因互补分析 断定突变体所涉及的基因数目 分析基因的结构 剖析遗传疾病的病因 杂种细胞测定不互补 缺失同一基因或同一基因产生同样突变 互补 缺失不同基因或同一基因不同部位发生突变 2 遗传疾病的治疗与基因互补分析 3 制备单克隆抗体 1 什么是单克隆抗体 回顾抗体基础知识抗体的化学本质是什么 抗体由何种细胞产生 用传统的方法如何获得抗体 三 单克隆抗体技术 抗体 能够与抗原发生特异性结合的免