1 超表达MfCOR1提高转基因烟草抗寒性和生物量 摘 要 黄花苜蓿 Medicago falcalta 是一种非常耐寒的豆科牧草 是苜蓿抗 性育种的重要基因库 在本实验室已构建了黄花苜蓿响应低温的 cDNA 消减 文库基础上 从中选择一个 cDNA 片段克隆其 cDNA 全长 605 bp 含有 579 bp 的开放阅读框 编码一个由 192 个氨基酸组成的蛋白 在 GenBank 中尚 无与该蛋白同源性高的序列 将编码该蛋白的基因暂命名为 MfCOR1 Medicago falcalta cold responsive gene 1 该蛋白高度亲水 N 端含 有叶绿体信号肽 推测其存在于叶绿体基质中 利用半定量 RT PCR 技术 分析了该基因在低温胁迫下的表达规律 在低温处理 2 4 h 时其表达已明显 受到诱导 低温处理 8 96 h 后其表达量一直维持在高水平 初步证明 MfCOR1 是低温诱导基因 构建了超表达载体 pBI MfCOR1 通过农杆菌介 导法转化烟草获得了转基因植株 经过 PCR 检测筛选出 51 株阳性植株 挑 选其中 15 株进行 Southern 杂交分析 结果表明这些转化植株来自不同的转 化事件 选择其中 3 个单位点的转基因植株 T1代幼苗进行 Southern 杂交和 RT PCR 检测 结果表明转基因能稳定遗传并且能表达 进一步比较测定了 低温胁迫对转基因植株 T1代幼苗及其野生型对照的影响 转基因株系在冷 冻胁迫下相对电导率的升幅和在冷胁迫下净光合速率的降幅均低于野生型 表明显著提高了抗寒性 充分证明 MfCOR1 是一个耐寒基因 与植物抗寒性 密切相关 转基因株系还表现为正常生长条件下苗期生物量显著增大 这与 其具有更高的光合速率有关 研究结果表明 MfCOR1 是一个新的耐寒基因 可能参与叶绿体光合作用 提高植物的光合速率 促进苗期的生物量积累 是一个很有应用潜力的新基因 可应用于改良农作物的抗寒性和提高生物产 量 2 关键词 耐寒基因 克隆 转基因烟草 抗寒性 生物量 Overexpression of MfCOR1 in Transgenic Tobacco Improves Cold Resistance and Biomass Abstract Medicago falcata is a kind of Leguminosae forage grasses which has strong tolerance to cold stress Because of its great resistance to cold drought and leanness Medicago falcate serve an important gene pool for crop resistance breeding A SSH cDNA library of cold responsive gene in Medicago falcata has been established in our laboratory in which MfCOR1 gene has been shown to be cold induced The full length of MfCOR1 cDNA is 605 bp which contains an open reading frame ORF of 579 bp and encodes a peptide of 192 amino acids but no obvious homological sequence has been found in GenBank The bioinformatics analysis indicats that the hydrophibic domain is dominant in the structure of MfCOR1 protein which has a predicted signal peptide of chloroplast and might be localized in stroma of chloroplast The expression pattern of MfCOR1 was analyzed by semi quantitative RT PCR The expression of MfCOR1 is rapidly induced in response to low temperature and sustained at high expression level up to 96 h after treatment The over expression vector of MfCOR1 pBI MfCOR1 was constructed The transgenic tobaccos were generated using Agrobacterium mediated transformation The transformant plants were analyzed using molecular determinations PCR detection screens 51 positive MfCOR1 transgenic lines 15 MfCOR1 transgenic plants were further analyzed by Southern blot Southern blotting indicates that MfCOR1 integrate into the genome 3 of tobacco from different transformed cases Southern blot and RT PCR analysis of 3 T1 plant lines indicates that MfCOR1 could inherite stably and express fully in the transgenic tobacco Further investigation demonstrate that under low temperature stress the transgenic tobacco lines compared with the wild type has a lower increase in comparatively conductance and decrease in net photosynthetic rate The transgenic tobaccos showed stronger cold resistance than the wild type and MfCOR1 was full proved to be a cold tolerance gene The results showed that MfCOR1 is closely related to plant cold resistance Under optimum growth conditions the transgenic tobaccos have a higher biomass than wild type plants as the result of the increase in the net photosynthetic rate in transgenic tobaccos The results showed that MfCOR1 is a novel cold tolerance gene it may be concerned with photosynthesis raise photosynthetic rate and biomass accumulation rate in seedling stage In a word MfCOR1 has great application potential in the aspect of improving cold resistance and production Key words cold tolerance gene cloning transgenic tobacco cold resistance biomass 低温是制约植物生长 降低其产量的非生物因素之一 低温不仅在很大 程度上限制植物的种植范围 还会造成作物减产和品质下降 严重时甚至导 致作物绝收 据统计 全球每年因低温伤害造成的农作物损失高达数千亿元 Deng et al 2001 在我国北方 晚秋和早春时期发生的低温危害常给越冬 作物和果木造成严重的伤害 而2008年春节前后 我国南方遭受的持续低温 Comment 木木木木1 删除 Comment 木木木木2 删除 Comment 木木木木3 也 4 和冰雪侵袭 更给农业生产带来巨大损害 随着基因工程技术在作物品种改 良方面取得了巨大进展 具有可控性强 效率高 周期短 成本低等优点的植 物基因工程技术已经成为新品种选育的一条全新而有效的途径 黄文攻等 2006 因而 随着分子生物学研究技术的发展 揭示植物耐寒分子机制 分 离和鉴定耐寒基因 有利于广泛开展抗寒基因工程的研究与应用 有效地提 高植物的抗寒性 减少低温伤害造成的经济损失 具有重要科学意义与潜在 应用价值 黄花苜蓿 Medicago falcalta L 是豆科苜蓿属多年生草本植物 广泛分 布于亚洲和欧洲 因起源于西伯利亚而具有非常强的耐寒性 同时 还具有 抗旱和耐贫瘠等特性 是苜蓿抗性育种的重要基因库 黄花苜蓿草质优良 适口性好 是我国北方寒冷地区的主要优良牧草之一 具有重要的饲用价值 遗传育种价值和生态价值 王俊杰等 2008 对苜蓿低温胁迫的研究 过去 主要着重于形态结构 生理特性以及不同抗性品种比较等方面 韩瑞宏等 2005 而耐寒分子机制方面研究不多 已经在紫花苜蓿 Medicago sativa L 和黄花苜蓿鉴定过的低温驯化特异基因 cold acclimation specific 包括 msaciA SM2075 SM2201 SM2358 msaCIC cas15 cas17 cas18 蔺忠龙等 2009 业已证明 低温引起细胞内Ca2 浓度短暂性增加是诱导冷适应基因 cas15表达所必需的 Monroy et al 1995 进一步研究揭示 Ca2 通过使蛋白 磷酸酯酶失活诱导cas15的表达 Monroy et al 1998 最近 通过对蒺藜苜蓿 Medicago truncatula L 和黄花苜蓿cas15和cas30的启动子比较分析 解释 了这两个基因在两种耐寒性差异较大的材料间响应低温表达差异的原因 可 能与CRT DRE调控元件在启动子区的拷贝数有关 Pennycooke et al 2008 但总的来说 目前对黄花苜蓿耐寒分子机制研究不多 已鉴定的少数几个cas 基因的功能及其调控抗寒性的机制仍不清楚 本实验室采用抑制性消减杂交 技术 SSH 构建了黄花苜蓿响应低温的cDNA消减文库 获得一批受低温诱 5 导表达的基因片段 Pang et al 2008 本研究从黄花苜蓿响应低温的cDNA消减文库中选择1个cDNA片段 GenBank注册号为ES323184 克隆其cDNA全长 发现它是一个未知功能 的基因 暂命名为MfCOR1 通过转基因技术使其在烟草中过量表达 并对T1 代转基因烟草进行抗寒性 生长状况及光合速率分析 为深入研究该基因调 控植物抗寒性的机制 进行作物抗逆基因工程育种打下基础 1 材料与方法 1 1 材料培养与处理 黄花苜蓿品种呼伦贝尔 Medicago falcata L cv Hulunbeier 种子用 60 热水浸泡 5 min 后 在