金线莲与菌根真菌共生萌发的营养及生态调控项目进展：一、金线莲与菌根真菌共生培养体系的建立1、促进形成共生的培养基筛选1.1第一批预试验1.2第二批预试验1.3第三批预试验1.4正式实验1.5正式实验22、不同基质上金线莲与真菌的共生2.1移栽苗二、菌根真菌组织学观察三、菌根真菌重分离与鉴定3.1丝核菌的分离3.2丝核菌培养性状的观察3.3丝核菌菌丝的观察及其直径的测量3.4丝核菌细胞核的染色3.5菌丝融合测定四、菌种的分子鉴定（正开展）现在已完成的四批预实验中，除第一批未达到预期目的外，其余三批预实验都能建立共生体系，并且形成共生类原球茎，进而分化成共生苗。四批预实验初步探讨了不同因素对共生体系建立的影响，为正式实验的进行提供依据。现已开展的正式实验2从不同因素、水平上探讨对金线莲与菌根真菌共生培养体系的建立的影响因素。同时，将第三批预试验的共生苗移栽，探讨共生苗在外界环境中的生长状况，为应用于生产提供依据。我们也进行了菌根的组织学观察，探讨了菌根的形成过程。菌根真菌重分离与鉴定阶段，我们探讨了与金线莲形成共生的三种真菌的形态特性、菌落特征，初步判断这三种真菌为同一菌属。现阶段的菌种的分子鉴定，目的是为了鉴定三种真菌是否为同一种，以及寻找真菌诱导金线莲特异表达的基因。一、金线莲与菌根真菌共生培养体系的建立1、促进形成共生的培养基筛选1.1第一批预试验2008.8.26目的：观察板栗叶对金线莲与真菌共生是否有促进作用方法：将苗分成尖、茎、头、全株几部分，分别接到带菌的板栗叶子上，板栗叶预先用PDB侵泡过，菌先于苗5天接种。同时设对照，培养条件分黑暗和光照两种。选板栗叶的原因：金线莲野外生长最适宜环境是山涧常绿阔叶林树林的枯枝落叶层中，并且根据文献可知板栗叶中有某种物质能促进丝核菌的生长。说明：材料来自生科院，分嫩苗、中等苗、老苗。尖指最苗的最上端部分，茎是苗中间部分，头指最苗下端，都带1-2个节。表1.1.1培养条件：25摄氏度 黑暗，提前5天接菌JSH-1时间10天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率共生关系备注嫩苗-尖180018100%否一些是腐烂大半，但几乎是死亡，活不了。嫩苗-茎5005100%否嫩苗-全株604233.33%否中等-尖5005100%否中等-茎63300%否气生根43100%否老苗-尖302133.33%否总共476103165.96%时间22天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率共生关系嫩苗-尖180018100%否嫩苗-茎5005100%否嫩苗-全株611466.67%否中等-尖5005100%否中等-茎611466.67%否气生根411250%否老苗-尖3003100.00%否总共47334187.23%表1.1.2培养条件：25摄氏度 光照，提前5天接菌JSH-1时间10天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率共生关系备注嫩苗-尖1001990%否嫩苗-茎7007100%否嫩苗-全株503240%否中等-茎1113763.64%否老苗-尖502360%否老苗茎12021083.33%否气生根10100%否总共511123874.51%时间22天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率共生关系嫩苗-尖100010100.00%否嫩苗-茎7007100.00%否嫩苗-全株5005100.00%否中等-茎110011100.00%否老苗-尖5005100.00%否老苗茎120012100.00%否气生根1001100.00%否总共510051100.00%表1.1.3培养条件：25摄氏度 光照，不接菌时间10天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率嫩苗-尖40400%嫩苗-茎503240%嫩苗-头301266.67%中等-茎650116.67%老苗-尖44000%老苗茎98100%气生根44000%总共35219514.29%时间22天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率嫩苗-尖4004100.00%嫩苗-茎5005100.00%嫩苗-头3003100.00%中等-茎610583.33%老苗-尖4004100.00%老苗茎950444.44%气生根44000.00%总共351002571.43%结果：4天后部分组织出现腐烂，10天后，接有菌的嫩苗几乎全部死亡，中老苗也出现大量死亡；对照大部分存活。22天后观察，接菌的几乎全部死亡；20黑暗条件下培养比25光照培养的稍好，但不接菌的相对生长良好，依然有几个存活，总体苗与菌没有形成共生。结论：板栗叶对金线莲真菌共生体系基本没有多大的促进作用，对丝核菌的生长有促进作用。1.2第二批预试验目的：比较在不加葡萄糖PDA（20%马铃薯+0.8%琼脂）、1/2PDA（20%+1%葡萄糖+0.8%琼脂）、PDA（20%+2%葡萄糖+0.8%琼脂）中带板栗叶和无板栗叶水的培养基中金线莲与丝核菌的共生情况。方法：将菌JSH-1与苗接到以马铃薯葡萄糖琼脂为基础的培养基上。培养基分为,全G（全葡萄糖） PDA、1/2G（1/2葡萄糖） PDA、 无G（无葡萄糖） PDA，部分还添加10%板栗叶汁，接菌时间分提前5天接菌和同时接菌两种，苗分为尖、茎、全株三种，培养条件为25摄氏度，光照培养。说明：下列表 “+”表示是或有，“-”表示否或无表1.2.1不同培养基中接菌金线莲出现类原球茎的情况培养基瓶编号株树同时接菌类原球茎最初出现类原球茎天数类原球茎个数(33或38天后)出现类原球茎株数平均类原球茎个数（个/株）备注全G板栗叶汁15-+1953无板栗叶汁35-+3022无板栗叶汁205+172041/2 G,板栗叶汁茎54-+1633茎+尖+全65-+1954尖73-+2311全83-+2332茎94+-00茎123+不祥不祥0污染不作记录尖163+-00无G 板栗叶汁全+茎+尖145+19不祥不详污染全+茎173-+1921全+茎185-+1832表1.2.2不同培养基中对照出现类原球茎的情况培养基瓶编号原球茎生长状况备注全GCK 板栗叶汁20良好污染 CK 无板栗叶汁 40良好污染1/2 G,板栗叶汁CK 茎100良好CK 尖110良好CK 全150良好无G 板栗叶汁CK 茎+尖190良好结果：4天后，全葡萄糖的、1/2葡萄糖的、无葡萄糖的都有出现发黄腐烂情况，而且几乎都是茎出现这种情况。13天后，全葡萄糖中有一瓶出现类原球茎。16天后，全葡萄糖、无葡萄糖、1/2葡萄糖各有一瓶出现类原球茎；20天后，总共有8瓶出现类原球茎。有类原球茎的多为茎部，也有在整株的节间生长，长有类原球茎的苗明显比没有的粗壮。在菌侵染初期，茎生长情况为表面呈发黄或停止生长状态。1.3第三批预试验2008.10.8目的：比较在DE、DE+1%板栗水、DE+5%板栗水培养基中，金线莲与JSH-1、JSH-4、JSH-5丝核菌的共生情况。方法：将苗（全株）与丝核菌同时接到以DE为基础的三种培养基上，观察其共生情况。菌种：JSH-1、JSH-4、JSH-5；培养基：DE、DE+1%板栗叶汁、DE+5%板栗叶汁。同时接全株苗，并在25光照培养，并以无接菌的相应处理为对照，每处理3重复。说明：材料来源生物研究所，苗总体比较弱，就其叶色可分两种，一种偏粉红、一种偏绿色，稍壮些。接种时随机，接种前对底部稍切割下，去掉黑色部分，全部无根。“+”表示粗壮非常好；“+”表示生长良好或稍瘦弱；“-”表示苗已经变黄，或上半节枯萎下面生长；“-”表示完全死亡。下述株高、鲜重、叶片数均为平均值。表1.3.1不同培养基中接菌金线莲的生长情况培养基菌种株高(cm）鲜重（g）叶片数接种当天(10.8)两个月后(12.7)接种当天(10.8)两个月后(12.7)接种当天(10.8)两个月后(12.7)DEJSH-13.0166674.9583330.126667未统计24.375JSH-42.0583335.0985350.1166671.749754.208333JSH-52.1916674.7166670.131.750254.541667CK2.4443.6330.1433332.5534.833333DE+1%板栗叶汁JSH-11.8555565.5150.14666723.666667JSH-41.2333333.780.081.3333.333333JSH-51.4111115.780.1211111.889