大学生科技创新漆酶高产菌株的筛选和产酶条件的优化符小燕 刁惠萍指导教师 林俊芳 研究员学院名称食品学院 专业名称03食品科学与工程摘 要漆酶是一种含铜的多酚氧化酶（Laccase ，pdiphenol oxidase ,EC1.10.3.2)，具有降解木质素，去除酚类和芳胺类化合物的毒性作用，漆酶的造纸工业，环境保护，食品工业具有广泛的应用价值。本课题主要选取实验室现有的大型真菌，及从野外采集华南地区特色菌株进行产漆酶菌株的初筛，并进行产酶条件的研究。实验结果如下：（1） 用PDABavendamn方法进行漆酶菌株的初筛。从69个土样和本实验室现有的大型真菌菌株共200株，筛选出两个漆酶野生菌株M1、M2及十六个大型真菌漆酶菌株。（2） 选取两个野生菌株M1、M2和一个大型真菌菌株（菌株2号）进行液体发酵，优化产酶培养条件。 比较研究了天然马铃薯培养基中添加不同营养物质的培养基对菌株M1，M14的产酶的影响。与其他培养基相比，添加有淀粉的PDA培养基漆酶活性较高。 对于菌株2号，摇瓶培养比静止培养能明显加快产酶的速度，缩短了最高产酶的天数。 不同碳源对菌株2号漆酶的分泌的影响很大，产漆酶最好的碳源是麦芽提取物，其次是淀粉和葡萄糖，最低的是蔗糖。 不同的葡萄糖添加量对菌株2号漆酶分泌影响不显著。 不同的氮源对菌株2号分泌漆酶活性影响很大，与无机氮相比，有机氮对漆酶分泌影响较大。最佳的氮源是酪蛋白胨，其次是酵母膏，漆酶活性最低是硝酸铵。 铜离子的菌株2号漆酶分泌影响较大，与对照（铜离子浓度0mmol/L）相比，添加铜离子达到终浓度为0.1mmol/L，漆酶最高活性提高3倍。(3) 比较目前研究最多的漆酶菌株侧耳和菌株2号分泌漆酶最高酶活，得出本实验筛选得到的菌株2号的最高酶活明显比侧耳的高，差不多是侧耳分泌漆酶最高酶活的2倍。关键词 漆酶 筛选 产酶条件目 录1 前言.1 2 材料与方法.2 2.1 材料. 2 2.1.1 土样.2 2.1.2 菌种 .2 2.1.3 试剂.2 2.1.4 主要试剂的配制.2 2.1.5 器材.3 2.2 培养基. 3 2.2.1 PDA固体培养基. 3 2.2.2 PDA液体培养基. 4 2.2.3 漆酶菌株初筛培养基.4 2.2.4 产酶培养基.4 2.3 方法. 4 2.3.1 漆酶菌株的筛选.4 2.3.1.1 土壤漆酶菌株的筛选. 4 2.3.1.2 现有大型真菌漆酶菌株的筛选. 4 2.3.2 漆酶菌株液体发酵培养.4 2.3.3 漆酶活性的测定. 5 3 结果与分析.5 3.1 漆酶菌株的筛选结果. 5 3.1.1 土壤中产漆酶菌种的筛选.5 3.1.2 现有的大型真菌漆酶菌株的筛选.6 3.2 漆酶菌株产酶条件的研究. 7 3.2.1 不同营养物质对M1和M14号菌株的产漆酶的影响. .7 3.2.2 摇瓶和静止培养对菌株2号漆酶分泌的影响. 8 3.2.3 不同碳源对菌株2号漆酶分泌的影响. .9 3.2.4 不同氮源对菌株2号漆酶分泌的影响.10 3.2.5 碳源添加量对菌株2号漆酶分泌的影响.10 3.2.6 铜离子对漆酶分泌的影响.11 3.3 与对照漆酶菌株（侧耳）漆酶活性的比较.11 4 讨论和结论.12 4.1 平板筛选产漆酶菌种.12 4.2 对M1和M2的产酶研究.12 4.3 对2号菌种的产酶条件的优化.12 4.4 2号菌种与对照漆酶菌株（侧耳）漆酶活性的比较.13 致词.14参考文献.15 英文摘要.171 前 言漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。按其来源主要分为漆树漆酶(Rhus Laccase)和真菌漆酶(Fungal Laccase)两大类,还有从稻根生脂固氮螺菌(Azospirilium Lipofcrum)上分离得到的细菌漆酶。此外,马铃薯、毒莴苣、香蕉、桃子、咖啡豆、苜蓿花等植物中也含有漆酶,甚至在一些动物肾脏(如猪肾)和血清中也发现了漆酶1。漆酶为含铜的糖蛋白，约由 500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。糖配基占整个分子的 10%45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用7。漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。在食品工业，由于能催化酚类物质的降解而广泛应用于饮品的澄清和稳定等方面3。此外，漆酶在酶免疫测定(EIA) 、生物检测及有机合成等方面得到了不同程度的应用。多年来，漆酶一直是研究的热点，涉及生物化学、物理、医学、环境等多个领域，尤其是它在木质素降解、微生物菌体形态发生以及植物病原等方面的研究较为突出,在制浆造纸工业的纸浆生物漂白、废水处理等方面更具有极大的环保研究价值和应用潜力。这一研究不仅为人类了解天然物质，探索生命现象提供信息，而且对生物资源的开发和利用都有重要意义2。因此,筛选一些漆酶高产菌株和研究产酶的优化条件是一项具有重要现实意义的工作。本实验从土壤、从野外采集华南地区特色菌株共200种菌株以及从实验室现有的大型真菌菌株中进行产漆酶菌株的筛选。并对各别筛选出菌种做产酶优化条件的研究。本实验不尽为实验室保留宝贵的菌种，也为菌种产酶条件的优化研究增添了丰富的资料，为今后漆酶的研究打下坚实的基础。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 土样 169号土样，采于华南农业大学的菜地、草地、树木园、湖边淤泥中及湖边的枯木堆中。2.1.2 菌种 野外采集具有华南地区特色大型真菌200种菌株（未知名）和实验室提供的一些菌种，如侧耳。2.1.3 试剂 愈创木酚 上海化学试剂总厂生产 分析纯ABTS2，2-Azino-bis-(3-ethylbenztbiozoline6-sulfonicacid)片剂，上海生工公司生产CuSO45H2O 广东台山粤侨试剂塑料有限公司 分析纯 柠檬酸 广州化学实际厂 分析纯柠檬酸钠 成都市联合化工试剂研究所 分析