活性氧在金鱼草切花向重力性反应中的作用研究作者姓名：刘华明 范 玉 李韵琦 陈会星 李 茂指导老师姓名：张昭其华南农业大学园艺学院，广州，510642摘 要向重力性反应是导致金鱼草等切花商品价值降低、包装运输成本高的重要原因之一。而植物的向重力性反应是一个复杂的生理生化过程，因此，研究金鱼草向重力性问题无论在理论上还是在实践上都具有重要意义。有研究表明，活性氧是细胞信号转导和调控组成成分，并且还参与了生长素介导的细胞伸长过程。与此同时，许多研究也表明Ca2+参与了植物向重力性反应的各个环节。本文从这个角度出发，综合考虑这两种重要因素对金鱼草向重力性反应的影响，采用能激发植物内源H2O2产生的水杨酸（SA）、过氧化氢酶（CAT）的抑制剂氨基三唑（AT）、NADPH氧化酶抑制剂Imadizole（Im）及一氧化氮释放剂硝普钠（SNP）处理采后金鱼草切花，研究这些药剂处理对抑制金鱼草向重力性反应中的效果及生理作用，并从生理和分子水平讨论4种主要的抗氧化酶CAT、APX、NADPH氧化酶、HATP酶与活性氧信号及金鱼草向重力性的关系，从分子水平探讨钙信号相关基因CDPK、CAM 与向重力性反应的关系。关键词：活性氧 抑制剂 诱导剂 金鱼草 向重力性AbstractThe Regulating Root Gravitropism has bad effects on cut flower, Antirrhinum majus for instancelower value and high cost of packaging and transportation. Its a complex physiological and biochemical process. So its significant to study the Gravitropism in theory and practice. Some studies showed that Reactive oxygen controlled to some degree the regulation in the Gravitropism of root. Whats more, it is component of cellular signal transduction and controlling,involved in auxin-mediated cell elongation. Research also shows that the Ca2 + are involved in the Gravitropism of root of the various links. From this perspective, we use medicaments of SA,CAT,AT,IM,SNP that can stimulate plants to produce H2O2 to handle Post-harvest Antirrhinum majus, research the effects and physiological function of medicaments processing on Regulating Root Gravitropism and discuss the connection between enzyme of CAT,APX,NADPH, HATP and signal of Reactive oxygen species and the Gravitropism at the physiological and molecular level and the relation of the Ca signal gene of CDPK、CAM and the Gravitropism at molecular level.Key words：Reactive Oxygen;Inhibitor; Inducer;Antirrhinum majus;Gravitropism16目 录1 前言42 材料与方法42.1 材料及处理42.1.1药剂浓度筛选42.2方法与步骤42.2.1 经药剂处理后切花形态特征的观察42.2.2生理指标的测定52.2.3 APX活性的测定52.2.4 H2O2含量的测定52.2.5 O-活性的测定52.2.6 NADPH活性的测定62.2.7 CAT活性的测定62.3基因的克隆及其表达62.3.1金鱼草总RNA的提取62.3.2 cDNA第一链的合成62.3.3相关基因cDNA片段的扩增和检测62.3.4相关基因的cDNA 3末端克隆62.3.5 Northern杂交方法72.4 数据处理73 结果与分析73.1 药剂处理后的金鱼草切花向重力性的表现73.2活性氧相关基因的克隆与序列测定93.3 酶活性的变化和活性氧相关基因的表达模式103.3.1 SA、SNP药剂处理与H2O2含量的变化103.3.2 SA处理对CDPK和CAT基因表达情况103.3.3 SNP处理对CDPK和CAT基因表达情况114 讨论13参考文献141 前言金鱼草（Antirrhinum majus L.）为玄参科秋播一年生草本，近年来培育出多种多倍体品种及优良的杂种一代，不仅花大而密、色彩艳丽、茎杆粗壮高大，而且耐寒性、抗病性都有所提高，花期又长，是园林中最常见的草本花卉。国际上广泛用于盆栽、花坛、窗台、栽植槽和室内景观布置，近年来常做线性花材用于插花观赏。金鱼草切花不耐挤压，但采切过早花蕾又不易开放，因此必须在花序基部有2朵-3朵花开放、上部花蕾初初绽时采切为宜。然而，金鱼草切花在水平装箱运输过程中，常发生花茎向上弯曲的现象，导致商品价值降低（高俊平，20031）。此现象称为“向重力性反应”。该类切花包装时需要垂直放置于专门设计的包装箱中，大大增加了鲜切花的包装运输成本。因此，我们需要找出抑制其向重力性反应的方法，通过测试经过处理后的氧化酶活性的变化及活性氧含量等生理指标，从而得出其反应的机理。2 材料与方法2.1 材料及处理从岭南花卉市场中国芊卉集团广州切花部购买前一晚采收次日凌晨空运到广州的有46朵小花开放的金鱼草切花，运回实验室，修剪切花基部，保持每支切花约50cm长，垂直插于盛有400ml蒸馏水的2L的量筒中过夜，所有切花即呈直立状态。第二天将垂直处理后的金鱼草切花取出，再把切花修剪成25cm长，插于盛有各种处理液（参照后面实验材料药剂处理方法）的1L的塑料量筒内，垂直或水平放置于实验台上（即给予重力性刺激）。金鱼草切花具有特定的向重力性反应部位，该部位位于花序顶部以下510cm的花茎，分别取该部位的上下侧的皮层组织，于药剂处理后的0、0.5、1、2、4、8h取样供指标测定。2.1.1药剂浓度筛选利用AT（氨基三唑）浓度筛选设置的浓度有1、10、15、20、30、40、50（mmol/L）、MJ（茉莉酸甲酯）（mmol/L）、（这个药剂的没有浓度筛选吧？ ）SA（水杨酸）浓度筛选设置的浓度有0.01、0.1、0.5、1（mmol/L）、 Imidazole（NADPH）抑制剂浓度筛选设置的浓度有1、10、15、20、30、40、50（mmol/L）和SNP（硝普纳）浓度筛选设置的浓度有0.05、0.07、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5（umol/L）等进行处理，对于各个药剂都通过设置浓度梯度筛选出最优的浓度。2.2方法与步骤2.2.1 经药剂处理后切花形态特征的观察将切花放入已设计好的浓度梯度药剂中处理，将鲜切花剪至50cm，置于装有500ml的对照和处理液的量筒中，垂直放置，处理24h后将花取出，再将其剪至35cm，放于水平放置的装有400ml的蒸馏水塑料瓶中，保持金鱼草鲜切花水平放置。观察得出不同药剂在处理后0、0.5、1、2、4、8h的金鱼草先端的弯曲程度，以及处理后金鱼草花蕾有无特殊变化，从中得出最有效的弯曲抑制剂浓度分别为：1mmol/L SA、0.2mmol/LSNP、15mmol/L AT以及50mmol/LIm。2.2.2生理指标的测定得出有效的药剂浓度后，我们将选择该浓度下进行切花处理，并切取该部位位于花序顶部以下510cm的花茎，分别取该部位的上下侧的皮层组织，于药剂处理的0、0.5、1、2、4、8h取样供指标测定。测定的指标包括H2O2含量、O-2含量、OH-含量、APX，CAT、NADPH氧化酶活性、Ca2-ATPase活性、NADPH 氧化酶等。2.2.3 APX活性的测定提取1g金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮，液氮研磨，加5 ml酶提取液(50 mM PBS,pH 7.0, 2mM AsA, 5mM EDTA，现配现用)，12000 rpm 于4下离心20min，得上清酶液5 ml左右，置冰浴中待用。先在比色皿中加入100ul的酶液，再加入2.75ml反应液（含50 mMPBS,pH7. 0, 0. 1 mMEDTA，0.3 mmol/L AsA），最后加入150ul0.1% H2O2启动反应，在290nm处测定OD290值变化，以OD290每分钟减少0.001表示一个酶活力单位（U）,酶的活性以Ug-1FW表示，重复3次。2.2.4 H2O2含量的测定参照周碧燕（2006）的方法并有所改动。取金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮1g，加入5ml 5% 4三氯乙酸（TCA）和0.2g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），以及少量活性碳，液氮或冰浴研磨，12000 rpm 于4下离心20min，上清液调pH值至8.4（25%氨水（200ul左右）2M乙酸），（过滤并用少量的5%TCA洗脱吸附在滤纸上的残余的溶液，）并用pH 8.4的TCA定容至6ml。取1ml上清液，30水浴30min，加入1ml显色液于500nm处比色，以1ml上清液中加入10ug过氧化氢酶作为空白，记录OD值，重复2次。从标准曲线上查OD值所对应H2O2数值，然后计算H2O2含量。2.2.5 O-活性的测定取1g金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮，液氮研磨，加50mM磷酸缓冲液(pH 7.8)，在 10000rpm 4离心 15分钟。取上清液 1ml加入磷酸缓冲液 0.9ml和 10mM盐酸羟胺0.1ml，在 25混合并培养20分钟。取 1ml培养液依次加入 1ml 17mM对氨基苯磺酸和1ml 7mM a萘胺，在 25反应 20分钟，10000rpm离心5分钟后分层 ,取正丁醇相测A530。用磷酸缓冲液代替样品作空白。2.2.6 NADPH活性的测定按Sagi和Fluhr（2001）的方法进行，采用提取纯化的细胞膜囊，通过NADPH氧化酶产生的活性氧氧化XTT的量来表示该酶活性。反应体系1ml包括50mm Tris-HCl 缓冲液(pH7.4) 0.5mm XTT,100m NADPH和15-20 g 蛋白量的细胞膜微膜囊，加入NADPH启动反应，XTT 减少量可通过470 nm检测。本底值（background production）可在反应系统中加入50 units SOD 测得。酶活性可通过XTT比吸收系数2.16104 m 1cm 1换算成活性氧的量来表示。2.2.7 CAT活性的测定参照戴宏芬（1991）的方法，酶液的提取同POD，3ml反应液中包括：1ml 0.2