第二章酶的分离和纯化IsolationandPurificationofenzyme 方法概括原料处理 包括组织破碎 缓冲液抽粗分级 一般采用硫铵沉淀 乙醇沉淀或其他方法细分级 一般采用离子交换层析 凝胶层析 亲和层析和电泳 1 2 第一节原料选择及预处理 动物原料 动物组织或脏器 活体取出 充分脱血 10 50 保存植物原料 植物原料磨碎加入缓冲液抽提植物原料特点 1 纤维含量高2 酚酶活力高3 缓冲液pH易被细胞内物质改变微生物原料 菌体培养做酶活 时间曲线确定最大酶活时间 3 细胞破碎 微生物细胞破碎一般采用1 化学法 碱 去垢剂 有机溶剂 酶解 冰冻复融2 物理法 热处理 渗透压 减压 声波振荡3 机械法 加磨料 研磨 挤压4 缓冲液抽提抽提缓冲液的加入要少量多次 植物酶抽提时可加5mM的Vc 4 第二节酶的粗提 沉淀核酸沉淀 a MnCl2 硫酸鱼精蛋白 链霉素可使核酸沉淀 离心除掉 b 加入核酸酶将其降解杂蛋白沉淀 根据目的酶的特性方法各异选择性沉淀 盐析 最常用的方法 5 沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力讨论 a 盐的加入速度合适 b 蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关 c 硫铵浓度表示法 饱和度25 4 1M d 硫铵饱和溶液pH 7 若目的酶易酸变性必须用缓冲液 e 硫铵溶液密度较高 1 24 故需较大离心力此步可除去75 以上的杂蛋白 且可使蛋白浓缩 6 透析与浓缩 1 透析袋处理 透析袋0 5MEDTA煮半小时蒸馏水煮半小时反复八次带橡皮手套用镊子拿取2 透析除盐 200倍于被透析物 4小时换一次透析液 监测电导值SephadexG25除盐 柱长50cm 上样小于床体积的20 3 浓缩 a 火棉胶b 聚乙二醇 PEG c 超滤 3 5kg cm2 d 冻干 7 透析技术原理图 8 超滤技术原理图 9 第三节酶的精制 一 层析技术 chromatography 1 分配层析 物质在两相中的分配系数不同a 纸层b 薄层 比纸层灵敏100倍但剥板困难 c 柱层2 吸附层析 absorptionchromatography 吸附剂对通过它的物质吸附力不同 吸附力包括离子引力 疏水作用 范德华力和氢键a 薄层b 柱层填料一般为硅胶 氧化铝 磷酸钙 活性白土和羟基磷灰石 常用羟基磷灰石 带正电 稳定范围pH5 5 10 吸附量1mg g湿剂 10 纸层 11 薄层 12 3 离子交换层析 ionexchangechromatography 交换剂上带电荷 可根据样品的电荷予以分离a 阳离子交换层析b 阴离子交换层析c 离子交换剂的类型 离子交换树脂 离子交换纤维素 离子交换凝胶d 实验室常用的离子交换剂 阴离子交换剂DEAE Cellulose DEAE Sephadex 阳离子交换剂CM Cellulose CM Sephadexe 离子交换剂的预处理 去杂质 溶胀 除小颗粒 改型阳离子交换剂 碱 水 酸 水 平衡阴离子交换剂 酸 水 碱 水 平衡 13 f 柱层析 床体积等于2 5倍束缚样品需要量 径 高 1 15 上样量不超过柱体积的10 注意上样方法 洗脱方法有两种 不连续梯度洗脱和连续梯度洗脱 分布收集器收集每管2 3mlg 交换剂后处理 饱和NaCl 水 酸或碱 水 平衡 14 连续梯度洗脱 梯度混合器 15 离子交换层析 阳离子交换剂阴离子交换剂 16 Anionexchangechromatography 17 4 凝胶层析 分子筛层析 gelfiltrationchromatography 根据分子量大小予以分离 a 凝胶预处理 凝胶 浸入洗脱液 轻轻搅拌 加热90 100 水浴加热 b 层析柱准备 2 5 100柱 稠胶灌柱 2 3个床体积的缓冲液平衡 流速16 18ml hc 层析 兰葡聚糖 分子量2 106 验柱并求外水体积 V0 上样量1 5 恒压洗脱 流速16 18ml hd 凝胶后处理 0 5NNaOH 0 5NNaCl处理后4 保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存 18 凝胶过滤层析原理图 19 Gelfiltrationchromatography 20 5 亲和层析 affinitychromatography 特异性结合 a 关键 配体 配体与支持物的连接方法 吸附 洗脱条件b 支持物的选择 非特异性吸附作用低 液体流动性好 较宽的pH 离子强度 丰富的化学基团 有效的多孔性常用琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球c 配体的选择 有亲和力但不易过大d 配体与支持物的连接 载体结合法 物理吸附法 交联法 包埋法 先活化支持物上的功能基团再将配体连上去 e 吸附剂的衍生物 支持物 空间臂f 层析条件的选择 蛋白质 配体 蛋白质 配体复合物起初配体浓度恒定 随蛋白浓度增加平衡右移 逐渐保留特性 故亲和力较低也能成功的亲和 g 洗脱 更高亲和力的物质置换 剧烈改变环境条件 21 亲和层析原理 22 Affinitychromatography 23 二 超离心技术利用物质的沉降系数 质量 浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离 F w2r F 相对离心力RCF RCF以g的倍数表示 RCF w2r 980w 转数 分 30RCF 1 119 10 5r 转数 分 2离心机 a 桌式 3000转 分红血球 酵母细胞等粗沉淀物b 高速离心机 20000 25000转 分一般实验使用但病毒 小细胞器或单个分子不能沉降c 超速离心机 75000转 分分子生物学必备 能分级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器 24 二 电泳 electrophoresis 技术 1 原理 M dL EtM 迁移率L 颗粒泳动距离t 通电时间E 电势差迁移率与下列因素有关 a 样品带电状态 分子形状与大小b 电场强度c 缓冲液pH的和离子强度d 支持介质的阻力 吸附作用2 电泳类型 a 纸电泳b 醋酸纤维薄膜电泳c 琼脂糖电泳d 聚丙烯酰胺凝胶电泳 25 PAGE和SDS PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Acr Bis TEMED 0 4 过硫酸胺 0 01 0 03 等电聚焦 isoelectricfocusing 两性电解质在电场作用下建立一个pH梯度分离蛋白质电泳检测 a 考马斯亮兰 氨基黑 染色法b 荧光染色法c 特异酶检测d 其他染色法 26 盘状电泳 A 和平板电泳 B 27 第四节提纯过程中的定量 蛋白质浓度 1 双缩脲法 Cu 与肽键及酪氨酸残基络合显色 测定浓度0 5 10mg ml2 Lowry法 双缩脲法的改进 Cu 与蛋白质在碱性溶液中络合 此络合物还原Folin试剂 测定浓度20 400 g ml3 紫外吸收法 Tyr Trp Phe在280nm有最大光吸收 此方法因上述三种氨基酸含量不同测定结果有误差测定浓度0 1 0 5mg ml4 Bradford法 该法是根据蛋白质与考马斯亮蓝 coomassiebrilliantblue 结合产生的蓝色物质在595nm有最大光吸收来测定蛋白质浓度的 该方法简单 快速 可靠 灵敏度高 可测定1 10mg的蛋白质 酶活力 检测目的酶的活力目的蛋白 非酶 检测较困难 28 纯化倍数 回收率 100 29 酶的提纯过程记录格式 30 第五节酶蛋白分子量的测定 渗透压法超速离心法凝胶层析法SDS 聚丙烯酰胺电泳法 31 渗透压法 M为蛋白质的摩尔质量 分子量 R为气体常数 0 082升 大气压 摩尔 度 T为绝对温度 为了测定蛋白质的分子量 分别取几个不同的蛋白质浓度c 测出对应的渗透压 然后以 c对c作图 并作延长线外推至c 0 得到的y轴截距即为lim c的值 代入上式可求得分子量M 渗透压法适合测定分子量范围在10 000 100 000的蛋白质 其优点是实验装置简单 测定也较为准确 缺点是要求蛋白样品纯度高 否则测出的将是溶液中各种蛋白的平均分子量 32 超速离心法 M 分子量S 沉降系数R 气体常数T 绝对温度D 扩散系数 溶质分子微分比容 介质密度 33 SDS 聚丙烯酰胺电泳法 M 被测蛋白分子量a b 常数 用已知分子量蛋白作标准曲线求得de 酶蛋白的泳动距离do 小分子染料的泳动距离亚基分子量 34 SDS PAGE的分子量标准曲线 35 凝胶层析法 M 被测蛋白分子量a b 常数 用已知分子量蛋白作标准曲线求得Ve 酶蛋白洗脱体积Vo 空体积 可用蓝葡聚糖求得 36 凝胶过滤分子量标准曲线 37 思考题 下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数 从表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶液的比活 哪一纯化步骤最有效 即相对纯度增加最大 哪一纯化步骤效率最低 按照表中的6个步骤纯化的酶是纯化的酶 表中结果是否有指示 有没有别的方法评价酶的纯度 38 39 作业 请说明酶纯化过程中常用的分离技术 从肝细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质 总活力为360单位 经过一系列纯化步骤以后得到的4mL酶制品 含有0 08mg蛋白 总活力为288单位 整个纯化过程的收率是多少 纯化了多少倍 40 后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用 41 主要经营 网络软件设计 图文设计制作 发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户 做到让客户满意 42 致力于数据挖掘 合同简历 论文写作 PPT设计 计划书 策划案 学习课件 各类模板等方方面面 打造全网一站式需求 43 感谢您的观看和下载 Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield 44 后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用 45 主要经营 网络软件设计 图文设计制作 发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户 做到让客户满意 46 致力于数据挖掘 合同简历 论文写作 PPT设计 计划书 策划案 学习课件 各类模板等方方面面 打造全网一站式需求 47 感谢您的观看和下载 Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield 48