2020 6 18 学习目的了解酶与酶工程的意义掌握酶的分类 催化调节特性及作用机制明确酶工程的概念熟悉大规模纯化酶技术的原理及应用 第一章酶学与酶工程 基础篇 1 2020 6 18 1 1概述 1 2酶的组成与结构特点 1 3酶的作用机制 1 4酶的催化作用动力学 1 5pH和温度对酶催化反应速度的影响 1 6酶的分离纯化 2 2020 6 18 1 1概述 一 酶与酶工程研究的意义研究酶的理化性质与作用机理对于阐明生命现象的本质具有重要意义 分子生物学研究的重要工具酶工程作为生物技术的一个重要分支 在食品 饲料 纺织 洗涤剂 医药和环保等行业发挥重要作用 3 2020 6 18 二 酶学研究简史1 酶的定义酶是具有生物催化功能的生物大分子2 发展历史国内 1 4000多年前的夏禹时代酿酒盛行 2 公元十世纪左右 我国已利用豆类作酱 3 约3000年前 人们利用麦曲淀粉酶将淀粉降解为麦芽糖制造饴糖 4 2020 6 18 1833年淀粉酶佩恩 Payen 和帕索兹 Persoz 从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种可使淀粉水解生成可溶性糖的物质 淀粉酶制剂 diastase 1878年ENZYME inyeast库尼 Kunne 首次将酵母中进行酒精发酵的物质称为酶Enzyme 这个词来自希腊文 其意思是 在酵母中 InYeast 1896年 德国Buchner兄弟发现酶的理化性质 开始了酶学的研究 1902年中间产物学说 1913年 米氏方程1926年酶的化学本质为蛋白质萨姆纳 Sumner 首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶 并证明它具有蛋白质的性质 提出酶的化学本质是蛋白质的观点 获1947诺贝尔奖 5 2020 6 18 1960年操纵子学说雅各 Jacob 和莫诺德 Monod 提出操纵子学说 阐明了酶生物合成的调节机制 1963年酶的一级结构 1965年酶的空间结构 1969年酶的人工合成 1982年核酸酶的发现 1983年核酸酶的确认切克 ThomasCech 等人发现四膜虫 Tetrahynena 细胞的26SrRNA前体在完全没有蛋白质存在的情况下自我加工 催化得到成熟的rRNA 说明RNA本身是生物催化剂 称其为 Ribozyme 对酶的传统概念提出了严峻的挑战 理论研究进展 6 2020 6 18 应用研究进展 1917年 法国人用枯草杆菌产生的淀粉酶作纺织工业上的退浆剂1949年 日本采用深层培养法生产 淀粉酶获得成功1959年 日本应用葡萄糖淀粉酶催化淀粉生产葡萄糖 使糖得率80 增加到100 70年代后 固定化酶技术发展 促进酶工程的发展 1969年日本千烟一朗首先在工业上应用固定化氨基酰化酶拆分DL 氨基酸获得成功 7 2020 6 18 三 酶工程简介1 酶工程的概念及研究领域酶工程 enzymeengineering 是生物工程的主要内容之一 是酶学和工程学相互渗透结合发展而成的一门新技术学科 是酶学 微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的交叉科学技术 它是从应用的目的出发研究酶 是在一定生物反应装置中利用酶的催化性质将相应原料转化为有用物质的技术 目前已经在自然界发现并鉴定的酶大约有8000种 广泛应用到工农业生产和科学研究种的只有800种 使用受到限制的原因 a不稳定 b分离纯化工艺复杂 c酶制剂成本高 根据研究和解决上述问题的手段 将酶工程分为 8 2020 6 18 化学酶工程 由酶学与化学工程技术相结合而成 主要通过化学修饰 固定化处理 甚至化学合成等手段改变酶的性质以提高催化效率和降低成本 一般包括 天然酶 化学修饰酶 固定化酶和化学人工酶的研究应用 生物酶工程 是以酶学和基因重组技术为主旨与现代分子生物技术相结合的产物 主要包括 a用基因工程技术大量生产酶 克隆酶 b修饰酶基因产生遗传修饰酶 突变酶 c设计新的酶基因合成自然界不曾有的新酶 9 2020 6 18 2 酶工程的发展史二战后 20世纪50年代开始 由微生物发酵液中分离出一些酶 制成酶制剂 60年代后 固定化酶 固定化细胞技术发展 使酶制剂的应用呈现新的面貌 1969年 日本千烟一郎首先用固定化酶技术成功拆分DL aa1971年 第一次国际酶工程会议在Hennileer召开 肯定了固定化酶技术的应用1983年第7届国际酶工程会议提出了酶分子的修饰和改造酶生物反应器的研究 出现酶膜反应器 免疫传感器 多酶反应器等酶抑制剂的研究 在代谢控制 生物农药 生物除草剂等方面发挥作用基因工程表达的酶 经分子改造和修饰的酶 模拟酶 抗体酶 杂交酶 非水相酶反应技术等是今后研究的热点 10 2020 6 18 一 蛋白酶的结构特点 一级结构蛋白质的肽链的化学结构 即通过肽键连接起来的氨基酸残基的数量 种类和顺序 1 2酶的组成与结构特点 11 2020 6 18 二级结构一级结构中相近的氨基酸残基键由氢键相互作用形成的带有 螺旋 折叠 转角 无规则卷曲等细微结构 螺旋 由蛋白质的肽链环绕中心轴有规则的一圈一圈盘旋而成的螺旋状构象 典型的 螺旋螺距5 4A0 平均含有3 6个氨基酸残基 折叠 由两条或多条肽链充分伸展成锯齿状的折叠结构 通过侧向聚集形成与肽链长轴方向平行的折扇状构象 其稳定性靠氢键维持 转角 是球状蛋白分子中发现的一种肽链主链构象 肽链盘绕折叠结构往往发生在180度的急转弯 从而产生 转角 无规则卷曲 肽链的主链不规则 多向性的随机盘曲所形成的构象 12 2020 6 18 螺旋结构模型 13 2020 6 18 螺旋结构模型 14 2020 6 18 片状结构模型 15 2020 6 18 16 2020 6 18 转角结构 17 2020 6 18 无规则卷曲 18 2020 6 18 三级结构螺旋状卷曲的多肽链通过氨基酸侧链之间的相互作用力进一步折叠而成的立体结构 部分蛋白质形成三级结构后就表现出生物活性了 溶菌酶的三级结构 19 2020 6 18 磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构 20 2020 6 18 四级结构寡聚蛋白中亚基的数目 种类和各亚基的空间排布及相互作用等 每个亚基一般就是一条多肽链 亚基间有非共价键维系在一起 包括 氢键 静电引力 范德华力和疏水相互作用 21 2020 6 18 StructureofyeastAcetohydroxyacidsynthase 22 2020 6 18 酶 蛋白质 各级结构的关系 23 2020 6 18 二 酶的组成 单体酶 只有三级结构 没有四级结构 种类很少 一般为水解酶类 如牛胰核糖核酸酶是由124个氨基酸残基组成的一条肽链 鸡卵清溶菌酶有129个aa组成寡聚酶 有两个或两个以上亚基组成的酶 即具有四级结构的酶 如E coli的RNA聚合酶由 亚基组成 多酶复合体 几种酶彼此嵌合形成一个复合体 在新陈代谢过程中的某一反应链中起作用 如脂肪酸合成中的脂肪酸合成酶复合体 24 2020 6 18 根据酶的组成成份分为单纯酶 组成成份中只有蛋白质 其活性取决于蛋白质结构 如脲酶 蛋白酶 淀粉酶 脂肪酶和核糖核酸酶等结合酶 除了蛋白质外 还有一些被称为辅助因子的小分子 辅助因子 cofactor 分为 无机辅助因子 低价金属离子 Fe2 Mg2 Zn2 Mn2 Ca2 有机辅助因子 有机小分子 NAD NADP FADFMNG SH 生物素等辅酶与辅基 辅助因子与酶蛋白的结合程度 25 2020 6 18 三 酶RNA的空间结构 化学结构核糖核酸由核苷酸通过磷酸二酯键联结成的 组成RNA的核苷酸种类 AGCU二级结构RNA的二级结构是指单链RNA分子的自身回折 链内互补碱基配对形成的局部双螺旋区及非配对顺序形成的突环之间的空间排布 在核酸类酶中发现的酶RNA的典型结构有锤头 发夹 多分枝环结构 三级结构RNA的三级结构是在二级结构的基础上 进一步盘绕折叠而成的三维结构 由于其复杂 加上分析测定方法还有待发展 所以知道不多 不作具体介绍 26 2020 6 18 酶RNA突环结构示意图 27 2020 6 18 几种简单的核酸类酶示意图 28 2020 6 18 一级结构的改变使酶的催化功能发生相应的变化 活性不变 例如牛胰核糖核酸酶 124个aa 的C 末端去掉3个氨基酸残基 从M1RNA 377核苷酸 的3 末端切去122个核苷酸残基 活性显示 例如胰蛋白酶原的活化 从N 末端切去个六肽Val Asp 4 Lys 活性显示 活性丧失 例如断裂位置在活性中心附近 牛胰核糖核酸酶的C 末端去掉4个氨基酸残基二级 三级结构破坏使酶的催化活性丧失 四 酶的结构与催化功能的关系 29 2020 6 18 四级结构受到破坏 酶功能和特性发生相应变化 多催化部位寡聚酶 亚基分离 一般情况下酶会失活 方法适当 保持 如天冬氨酸转氨酶 琥珀酰化法破坏 分离的2个亚基催化活性保持 酸碱 表面活性剂破坏 失活 多酶复合体 亚基的酶活性减弱或消失 别构酶 催化亚基保持酶的催化活性 但失去调节功能 如天冬氨酸转氨甲酰酶的2个催化亚基C3和2个调节亚基R2 30 2020 6 18 本节课应掌握的内容 深入了解生物工程研究领域的内涵熟悉酶工程的概念及其研究领域 包括化学酶工程和生物酶工程 明确酶的各级结构及结构与其催化活性的关系了解酶有哪几种组成形式 31 2020 6 18 酶的活性中心酶与底物结合的两种模型酶促反应的本质 1 3酶的作用机制 32 2020 6 18 掌握酶活性中心的概念熟悉酶活性中心残基的种类和作用掌握酶的催化作用机理了解核酸酶的剪接机制 本节课应掌握的内容 33 2020 6 18 一 酶的活性中心 活性中心 activesite 酶分子中显示酶的催化活性的特殊部位 活性中心被破坏 酶失去催化活性 酶活性中心上的残基在酶蛋白分子的众多氨基酸残基中 构成酶的活性中心的只有少数几个氨基酸残基 如胰凝乳蛋白酶活性中心由5个氨基酸残基组成 它们为Ile16 His57 Aspl02 Lysl94和Ser195 1960年 柯施兰德 Koshland 将酶分子中的氨基酸残基分为以下四类 34 2020 6 18 接触残基 contractresidues 它们直接与底物接触 参与底物的化学转变 如图中的R1 R2 R6 R8 R9 R163 R164 R165 这些氨基酸残基中的一个或几个原子与底物分子中的一个或几个原子的距离都在一个键距离 1 5 2Ao 之内 辅助残基 auxiliaryresidues 这类残基虽然不与底物直接接触 但在酶与底物结合以及协助接触基团发挥作用方面起一定的作用 如图2 8中的R4残基 接触残基和辅助残基组成酶的活性中心 35 2020 6 18 结构残基 structureresidues 这类残基不在酶的活性中心范围内 但是在维持酶分子的完整的空间结构并使之形成特定的空间构象方面起重要作用 如图中的R10 R162 R169残基 它们与酶的催化活性的显示有关系 又称为贡献残基 contributingresidues 结构残基的侧链属于活性中心以外的必须基团 上述三类残基统称为必需基团 若被其它氨基酸残基取代 往往造成酶失活非贡献残基 non contributingresidues 这类残基对酶活性的显示无明显的作用 可以有其他氨基酸残基代替 如图中的R3 R5 R7等 它们在酶分子中占有很大的比例 如木瓜蛋白酶分子中的2 3氨基酸残基都属于非贡献残基 非贡献残基虽然对酶活性的显示无明显作用 但它们可能在酶的活性调节 酶的运输转移 防止酶的降解 免疫作用或种系发育等方面起重要作用 36 2020 6 18 接触残基 R1 R2 R6 R8 R9 R163 R164 R165 辅助残基 R4 结构残基 R10 R162 R169 非贡献残基 R3 R5 R7 37 2020 6 18 酶蛋白分子中的各种氨基酸残基的作用可以归纳如下 酶分子 接触残基 辅助残基 结构残基 非贡献残基 有7种氨基酸参与蛋白酶