第五章细胞工程及其在食品工业中的应用 1 细胞工程 cellengineering 是以细胞生物学和分子生物学为基础理论 采用原生质体 细胞或组织培养等试验方法或技术 在细胞水平上研究改造生物遗传特性 以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物 并发展有关理论和技术方法的学科 细胞工程的核心技术 细胞培养与繁殖目的 获得新性状 新个体 新物质 一细胞工程的定义 第一节 细胞工程的概念与研究范畴 2 二细胞工程的研究范畴 细胞融合细胞拆分动物细胞与组织培养植物细胞与组织培养细胞核移植染色体工程胚胎工程干细胞与组织工程 3 三 细胞工程的发展 1动物细胞工程的发展 4 5 6 7 2植物细胞工程的发展 8 9 10 11 12 13 14 15 细胞学说的建立胚胎学的发展分子生物学的发展 四 细胞工程的理论基础 16 五 细胞工程的基本技术 17 植物细胞工程 18 植物细胞工程的基本技术和理论基础 植物细胞工程的理论基础是 植物细胞的全能性 概念 细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能 原因 是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因 19 细胞的全能性 当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时 在一定的营养物质 激素和其他外界条件的作用下 就可能表现出全能性 发育成完整的植株 在生物的个体发育中 由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官 因此 要实现细胞的全能性 首先必须使生物体的细胞处于离体状态 20 从健康植株的特定部位或组织 如根 茎 叶 花 果实 胚珠 花药和花粉等 选择用于组织培养的起始材料 称之为外植体 用一定的化学药剂 最常用的有次氯酸钠 升汞和酒精等对外植体表面消毒 建立无菌培养体系 严格控制无菌条件 这是获得培养成功的重要一步 外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织 由愈伤组织分化出芽并可诱导形成根的小植株 1 植物细胞和组织培养技术 21 22 植物组织培养的过程 离体的植物器官 组织或细胞 脱分化 又叫去分化 愈伤组织 排列疏松而无规则 高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞 再分化 根或芽等器官 植物体 23 二 植物组织培养 植物组织培养过程 24 25 相关问题 1 在植物组培过程中 为什么要进行一系列的消毒 灭菌 并且要求无菌操作 2 为什么切取胡萝卜根的形成层 其他部分也能培养成小植株吗 26 植物体细胞杂交的概念 将不同种植物的体细胞 在一定条件下融合成杂种细胞 并把杂种细胞培育成新的植物体的技术 不同种生物之间存在着生殖隔离 所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的 27 相关问题 1 要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起 遇到的第一个障碍是什么 2 有没有一种温和的去细胞壁的方法 3 为什么两个原生质体能发生融合 这与细胞膜的什么特性有关 4 如果两个来源不同的原生质体发生融合形成了杂种细胞 下一步该对此细胞做何种处理 5 如何将杂种细胞培育成杂种植株 28 植物体细胞杂交过程 杂合的原生质体 杂种细胞 愈伤组织 杂种植株 29 植物体细胞杂交过程 原生质体制备 酶解法去细胞壁 原生质体融合 人工诱导 杂种细胞的筛选和培养 形成愈伤组织 杂种植株的再生与鉴定 物理法 离心 振动 电刺激等化学法 聚乙二醇等试剂 纤维素酶 果胶酶等 30 问题 为什么 番茄 马铃薯 超级杂种植株没有如科学家所想像的那样 地上长番茄 地下结马铃薯 主要原因是 生物基因的表达不是孤立的 它们之间是相互调控 相互影响的 所以马铃薯 番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质 但这些遗传物质的表达受到相互干扰 不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达 杂交植株不能地上长番茄 地下结马铃薯就是很自然的了 31 问题 自然界中有一种含有叶绿体的原生动物 眼虫 说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活 请探讨 动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗 如果理论上可行 请设计出具体实验方案 32 异想天开 33 植物细胞工程的实际应用 繁殖植物的新途径微型育种作物脱毒人工种子育种新方法单倍体育种诱导突变体细胞产物的工厂化生产 34 概念 应用组织培养技术 快速繁殖植物 也叫快速繁殖技术 原理 植物细胞的全能性优点 繁殖率高 可大批量生产取材少培养周期短保持优良性状 微型繁殖 35 作物脱毒 病毒在作物体内逐年积累 会导致作物产量降低 品质变差分生区附近 茎尖 根尖 的病毒极少 甚至没有采用茎尖进行组织培养 36 人工种子 结构 人工薄膜 胚状体 不定芽 顶芽 腋芽 优点 不受气候 季节 地域的限制保留优良性状时间短 占地少技术 组织培养原理 细胞全能性 37 养分 无机盐 有机碳源 农药 抗生素 有益菌生长调节剂 38 单倍体育种 方法 花药离体培养技术 组织培养获得单倍体秋水素处理单倍体的幼苗 使染色体加倍优点 明显缩短了育种年限后代稳定遗传 39 突变体的利用 利用组织培养时 分裂状态的细胞易受培养条件和外界压力 如射线 化学物质等 的影响而产生突变的原理 诱导并筛选出对人类有用的突变体 40 细胞产物的工厂化生产 红豆杉与紫杉醇 人参皂甘的生产 41 植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中 将组织振荡分散成游离的悬浮细胞 通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法 植物细胞和组织培养技术 PCTC 目前 植物细胞培养技术已在农业 医药 食品 化妆品 香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品 小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成 而大规模的培养可在发酵罐中进行 42 植物细胞培养基通常包括无机盐 碳源 维生素 生长调节素和有机添加剂等 无机盐类包括 无机盐浓度一般为多少 微量元素主要包括碘 硼 锰 锌 钼 铜 钴 铁等 碳源和能源维生素植物细胞的生长都需要硫胺素 可在植物细胞培养基中加入烟酸 吡哆醇 泛酸 生物素和叶酸等 原生质体培养通常需要大多数必需维生素 1 植物细胞培养基的组成 43 植物生长激素大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激素 生长激素包括了植物生长素 细胞激动素 赤霉素和脱落酸等四大类 有机氮源通常采用的有机氮源有蛋白质水解物 谷氨酰胺或氨基酸混合物等 有机酸加入丙酮酸 或者柠檬酸 苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中间产物 能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长 并且使细胞对钾盐的耐受能力至少提高到10mmol l 除此之外 这些有机酸还能提高低密度接种的细胞和原生质体的生长 复合物质在植物细胞的培养过程中 酶母抽提液 麦芽抽提液 椰子汁和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂 44 类型和方法 悬浮培养和固定培养悬浮培养方法要求 材料 疏松易碎的愈伤组织 经过破碎的颈部组织 条件 水平震荡 合适的气体组成 pH特点 对剪切力敏感结团生长速度慢多泡沫光照无菌培养 45 图12 2大规模植物细胞固定化装置 含CaCl2的培养基 盖子 空气出口 海藻酸钠 细胞悬浮液 喷嘴 无菌空气入口 大规模固定化植物细胞的大规模固定化原则上可根据上述方法进行 但是不能再用塑料注射器 而需要采用如图12 2所示的大规模细胞固定化装置进行细胞的固定化 46 动物细胞工程应用 47 动物细胞培养 动物细胞融合 单克隆抗体技术 核移植 动物细胞工程常用技术 48 人耳鼠 人耳鼠 再出风头2001年 一只特别的活老鼠在北京引起轰动 这是有着一对红眼睛的 尾巴长长的 浑身没毛的小白鼠 值得一提的是 这只小白鼠的背上 竟长着一只几乎与身子一般大小的 人耳 这只老鼠背上的 人耳 是由上海市第九人民医院副院长 整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的 在京展出的数天 尽管门票高达20元 但还是有将近20万人 心甘情愿地掏钱一睹 人耳鼠 的风采 人耳鼠的出现 透露了怎样的信息 49 1 发展历史 20世纪初 人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的 还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的 生物学家们就这个问题展开了激烈的争论 1907年 美国生物学家哈里森 Harrison 从蝌蚪的脊索中分离出神经组织 把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养 蝌蚪的神经组织存活了好几周 并且从神经细胞中长出了神经纤维 哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题 而且开创了动物组织培养的先河 此后 在许多科学家的不懈努力下 动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养 动物细胞培养 50 2 动物细胞培养的应用和概念 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织 将它分散成单个细胞 然后 放在适宜的培养基中 让这些细胞生长和增殖 51 动物细胞的培养过程 幼龄动物 取动物器官和组织 剪碎组织 胰蛋白酶处理 细胞培养 单个细胞 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础 剪碎组织的目的 胰蛋白酶处理的目的 52 53 3 动物细胞培养过程 动物胚胎或幼龄动物的组织 器官 细胞悬浮液 胰蛋白酶 10代细胞 原代培养 传代培养 无限传代 单个细胞 加培养液 动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质 将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官 分解弹性纤维 54 有关概念 原代培养 从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞 分装前的细胞培养 传代培养 将原代细胞从培养瓶中取出 配制成细胞悬浮液 分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养 称为传代培养 55 有关概念 细胞株 传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞 大部分细胞衰老死亡 少数细胞存活到40 50代 这种传代细胞为细胞株 细胞系 细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态 只有部分细胞由于遗传物质的改变 使其在培养条件下可以无限制传代 这种传代细胞为细胞系 细胞株和细胞系的区别 细胞系的遗传物质改变 具有癌细胞的特点 失去接触抑制 容易传代培养 56 动物组织细胞培养要求 一体外培养特点 大多数动物细胞要附在物体上表面生长 动物细胞培养对营养要求更严格 除氨基酸 维生素 盐类 葡萄糖外 还需要血清 对环境适应性差 对环境敏感 包括 PH 溶解氧 温度 剪切力等比微生物要求更高 57 二培养工具 培养瓶 培养皿 培养管 多孔培养板等 细胞培养以玻璃器皿为主 器皿应选择透明度好 无毒 中性硬度玻璃制品 58 根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异 用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀 便于细胞贴壁生长和观察 瓶口要大小一致 口径一般不小于1cm 允许吸管伸入瓶内任何部位 59 三 培养条件细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同 讨论 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中 讨论以下问题 1 体外培养细胞时需要提供哪些物质 提示 充足的营养供给 适宜的温度 适宜的pH和气体环境 2 体外培养的细胞需要什么样的环境条件 提示 无菌 无毒的环境 60 1 恒定的温度 37 维持培养细胞旺盛生长 必须有恒定适宜的温度 人体细胞培养的标准温度为36 5 0 5 偏离这一温度范围 细胞的正常代谢会受到影响 甚至死亡 培养细胞对低温的耐受力较对高温强 温度上升不超过39 时 细胞代谢与温度成正比 人体细胞在39 40 1小时 即能受到一定损伤 但仍有可能恢复 在40 41 1小时 细胞会普遍受到损伤 仅小半数有可能恢复 41 42 1小时 细胞受到严重损伤 大部分细胞死亡 个别细胞仍有恢复可能 当温度在43 以上1小时 细胞全部死亡 低温下会使细胞代谢速率降低 61 2 PH 7 2 7 当PH低于6或高于7 6时的生长会受到影响 甚至死亡 用来检测PH的变化 红色 pH7 4 橙色 pH7 0 黄色 pH6 5 蓝红色 pH7 6 紫色 pH7 8 62 3 气体 有调节PH的作用 气体是人体细胞培养生存必需条件之一 所需气体主要有氧气和二氧化碳 氧气参与三羧酸循环 产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分 开放培养时一般把细胞置于95 空气加5 二氧化碳混合气体环境中 6