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革兰氏染色液的配制一、实验试剂:(结晶紫、草酸铵、碘、碘化钾、番红)1. 结晶紫溶液:A液:结晶紫:2g,95%乙醇:20ml。B液:草酸铵:0.8g,蒸馏水:80ml。需在用前24小时将A液. B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用.2. 碘液:碘:1g,碘化钾:2g蒸馏水:300ml。出碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升水,使其逐渐溶解,然后研磨,继 续加入少量蒸馏水至完全溶解,最后补足水量。也可用少量蒸馏水,先将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。3. 脱色液:95%乙醇。4. 复染液:A.贮存液:番红:2.5g,95乙醇:100ml。B.应用比例:A液:10ml,蒸馏水:90ml。菌片制备:染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时,用接种环蘸取菌液点在载玻片上,标本可直接在玻片上涂布,菌落涂片时,先取生理盐水1滴,置玻片上,用接种针挑去菌落,在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式,或造成细菌鞭毛脱落,影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥,并经火焰固定,固定温度不易过高,以玻片背面接触手背不烫为准,否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。操作步骤:1 涂片将培养的不同菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥、固定。固定时通过火焰1一2 次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。2 染色( 1 )初染加草酸铰结晶紫一滴,约一分钟,水洗。( 2 )媒染滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。( 3 )脱色将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95 酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20 一30 秒钟,立即用水冲净酒精。( 4 )复染用番红液染1 一2 分钟,水洗。( 5 )镜检干燥后,置油镜观察革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。
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