HPV核酸扩增分型检测项目 常见问题分析 凯普科技生物有限公司 2006.12,目录,项目开展的要求 宫颈细胞样本的采集 宫颈细胞DNA的提取 PCR实验过程 导流杂交过程 结果判读,凯普HPV核酸扩增分型检测项目的开展要求,1.HPV项目开展对实验室的要求有哪些？ 临床基因扩增实验室设置 十六字方针 各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作,基础HPV 基因分型 实验室布局,最佳的HPV 基因分型 实验室布局,凯普HPV核酸扩增分型检测项目的开展要求,2.除了凯普医用核酸分子快速杂交仪外，凯普HPV核酸扩增分型检测项目在实验设备方面还需要哪些仪器设备？ 答： 标准型设置：按卫生部临检中心基因扩增实验室标准的实验室配置。在第4区（产物分析区）设置杂交仪和水浴锅做杂交分析。 经济型设置：分隔的房间（保证PCR产物的杂交不能污染到PCR前的实验过程）。PCR仪、至少2套微量移液器、超净工作台或生物安全柜、水浴锅/干热器、离心机、涡悬混匀器。,实验所需仪器,HybirMax医用核酸 分子快速杂交仪,PCR扩增仪,超净工作台,水浴锅,离心机,旋涡混合仪,微量移液器,宫颈细胞样本的采集,1.在宫颈细胞采集过程中应该注意哪些问题？ A 不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本。 B 检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。 C 检查前48小时最好不要行性生活。 D 月经期不可采集标本。 E 液基细胞学样本可以用于HPV检测。 F 注意避免交叉污染。,宫颈细胞样本的采集,2.样本采集中可否用棉拭子代替宫颈细胞采集刷？ 答：凯普宫颈细胞采集器及细胞保存系统对于采集足够的宫颈脱落细胞和长期保存细胞样本十分必要。 并且为了保证所采集细胞样本的质量，最好在采集细胞前先用棉拭子拭去宫颈口的分泌物。 不能保证避免用棉拭子采集的样本及其他缓冲液的保存条件对实验结果的不良影响。,凯普一次性使用宫颈细胞采集器,宫颈细胞DNA的提取,宫颈细胞DNA的提取过程中常见问题有哪些？ 答： A 样品中有黏液性物质会导致离心时不能把细胞等固形物离心到管底。 可采取增大离心速度增长离心时间的方法使细胞离心到管底。或者用PBS或生理盐水洗涤一次后再离心。 B 丢弃上清时注意不要损失管底的沉淀。 C 在沉淀了DNA后，一定要在溶液挥发干净之后再溶解DNA。 D 注意避免交叉污染。,DNA提取试剂盒,PCR实验过程,在PCR实验过程中要注意那些问题？ A 注意避免污染。 B 移液器尽量准确，避免由于加样过程中的损失造成试剂量的不足（主要是Taq酶）。每个试剂盒均有多加3人份，如果发现试剂不够请先校准所用移液器，同时避免多次吸取液体。 C PCR反应管要求使用200ul薄壁管。 D 注意试剂的有效期，避免反复冻融。 E 保证PCR仪正常工作。,PCR扩增试剂盒,导流杂交过程,1.在导流杂交实验过程中需要注意哪些？ A 保证加热仪器的温度在95以上，确保PCR产物的完全热变性。 B 变性后的PCR产物应该立即置于冰水中，避免在室温下暴露而使DNA复性。 C 在安装金属多孔板时，确保多孔板在卡槽内。否则会导致不能有效泵走液体。 D 分隔膜的多余孔位必须封住。也要确保杂交膜正确覆盖在分隔膜上。 E 每次清洗膜时，抽液干净。 F 确保实验用液体充分溶解并处于合适的温度。 G 注意杂交仪的保养。,杂交试剂盒,2.杂交试剂出现沉淀样物质是否可以继续使用？ 答：溶液A/B 从冰箱中拿出有沉淀为正常现象，45水浴加热可以溶解，不影响实验结果。 封阻液有絮状沉淀或结块可能为微生物污染。在实验过程中使用的枪头要求经过灭菌处理。试剂按说明书要求的保存条件贮存。,导流杂交过程,结果分析及常见问题,正常阳性结果,正常阴性结果,结果分析及常见问题,1.在杂交膜上既无IC点，也没有HPV分型阳性点显色。,结果分析及常见问题,2、IC点弱或者没有，但HPV分型阳性点显色正常。 可能原因： 由于IC和HPV DNA之间存在竞争，高浓度的HPV DNA可能会对IC点的扩增反应产生竞争性抑制。 如HPV分型点显色正常，则分型结果正确。,3、Biotin（生物素）点不显色 可能原因：请确认所使用试剂是否仍在有 效期内。尤其是酶标液及显色 液是否按要求使用及储存。 确定实验操作是否严格按照说 明书进行、且试剂是否按要求保 存使用。,结果分析及常见问题,4、阴性对照显现HPV分型阳性点 可能原因：PCR试剂可能被污染，取5 l PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳分析。 重复进行PCR及杂交试验,。,结果分析及常见问题,5、杂交膜有很高的背景 可能原因： 可能由于封闭不足，使未结合 的酶标残留在膜上。确保封闭液 完全覆盖整个杂交膜。 也可能因为没有完全将未结合 的试剂清洗干净，请确保在显色 过程中杂交膜充分清洗，无剩余 残留液体。,结果分析及常见问题,6、什么时候需要做阳性及阴性对照？ 当一个新的医院，一个新的地方开展试验的时候，或更换试验地点的时候，建议进行阴阳性对照试验。 当使用的检测试剂批次改变的时候，建议做1次阴阳性对照。 当杂交结果令人疑惑时，需要使用同批试剂进行阴阳性对照试验以验证问题所在。 怀疑污染时，多个样本的杂交结果一样，同一亚型反复出现，杂交结果出现过多的多重感染； 杂交试验后出现许多无IC点的结果。,结果分析及常见问题,7、导流杂交试验中的污染主要会出现在那一步中，应该怎样防范？ A 最严重的污染是PCR产物污染了PCR前区或试剂。 实验过程中严格按照实验室操作规程操作。避免PCR后区的物品进入PCR前区。 B 样本DNA交叉污染。 认真谨慎操作可以避免样本的交叉污染。 C 杂交结果中出现的一些弱的杂交点可能不是污染造成，而是杂交温度不符合要求而造成的非特异性点。 最终结果如果出现杂交点较弱的情况 (肉眼很难看出)，此点可以不用判读。凯普HPV分型检测项目现在配有微阵列芯片阅读仪自动判读实验结果，使结果的判读标准化。,结果分析及常见问题,HPV 34,弱 IC, HPV(-),电泳阳性,其他HPV亚型,8、HPV杂交结果为阴性，但电泳结果为阳性 此种情况较少。可能原因为电泳所检测到的HPV DNA不包含在凯普试剂盒所能检测到的21种亚型内。,结果分析及常见问题,9、杂交后的杂交膜没有形成均一的杂交边缘，而且出现同一次杂交结果互相污染的现象。 可能原因： 分隔膜没有放好，没有形成每个样本独立的杂交间，所以出现了杂交膜之间的互渗、反渗以及下渗现象； 验证方法： 在进行预杂交的时候，首先要将杂交膜上的残留溶液全部抽干净，然后先将杂交液加入不相邻的几个杂交孔中，观察其他几孔杂交膜12分钟后，如果杂交膜没有出现润湿或者杂交膜表面出现水珠现象（注意杂交膜边缘），则可以继续试验。 预杂交结束后，开泵将预杂交液完全抽干，然后继续开泵12分钟，关泵，等待12分钟，再加PCR产物及杂交液，将会减少反渗现象。,结果分析及常见问题,分隔室有渗漏,结果分析及常见问题,谢 谢！,凯普生物科技有限公司 香港：电话：0085228518029 传真：0085228518062 潮州：电话：0768-2852923 传真：0768-2852920 上海：电话：021-57740078 传真：021-57740087 广州：电话：02037617377 传真：02037616715,