欢迎阅读 欢迎阅读 第一章基因工程 第一节基因工程概述 一基因工程的概念 操作 环境 操作 对象 操作 水平 基本过程结果 生物 体外 基因 分子 水平 剪切拼接导入 表达 人类需要的基因产物 由于基因工程是在DNA 分子水平上进行操作 , 因此又叫做 重组 DNA 技术。 二基因工程的基本工具 （一）“分子手术刀”限制性核酸内切酶 （简称 限制酶 ） 1来源：主要是从 原核生物 中分离纯化出来的。 2功能：能够识别双链DNA 分子的某种 特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两 个核苷酸之间的 磷酸二酯键 断开。 3结果：经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式：黏性末端 和平末端。 （二）“分子针线”DNA 连接酶 1分类：根据酶的来源不同，可分为EcoliDNA 连接酶和 T4DNA 连接酶两类 2功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 两种 DNA 连接酶(EcoliDNA 连接酶和 T4DNA 连接酶 )的比较： 相同点：都缝合磷酸二酯键 区别： EcoIiDNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端 之间连接； T4DNA 连接酶能缝合 两种末端 ，但连接平末端之间的效率较低。 DNA 连接酶与 DNA 聚合酶作用的比较 DNA 连接酶DNA 聚合酶 不 同点 连接的 DNA 双链单链 模板不要模板要模板 连接的 对象 2 个 DNA 片段单个脱氧核苷酸加到已存在 的单链 DNA 片段上 相 同点 作用实 质 形成磷酸二酯键 化学本 质 蛋白质 (三) “分子运输车” 载体 1. 载体具备的条件： 能在受体细胞中 复制并稳定保存 ； 具有一至多个 限制酶切割位点 ，供外源 DNA 片段插入； 具有 标记基因 ，供重组 DNA 的鉴定和选择。 2. 基因工程常用的载体有：质粒 、 噬菌体和 动、植物病毒等。 最早应用的载体是 质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状 DNA 分子。 欢迎阅读 欢迎阅读 三基因工程的基本过程 ( 一) 获得目的基因（目的基因的获取） 1. 获取方法主要有两种：从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。 用人工的方法合成。 获得原核细胞的目的基因可采取直接分离 ，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成 。 人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。 2. 利用 PCR技术扩增目的基因 （1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。 （2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理： DNA 双链复制 （4）过程：第一步：加热至9095DNA 解链为单链 ； 第二步：冷却到5560，引物与两条单链 DNA 结合； 第三步：加热至7075，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数形式扩增 ( 二) 制备重组 DNA 分子（基因表达载体的构建） 1重组 DNA 分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因 。 标记基因的作用： 鉴定受体细胞中是否含有 目的基因 ，从而将 含有目的基因的细胞 筛选出来。 2方法： 同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA 连接酶把两者连接。 (三) 转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞） 1. 转化的概念：是 目的基因 进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定 和表达的过程。 2. 常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌 介导转化技术（ 农杆菌 转化法），其次还 有基因枪 介导转化技术（ 基因枪 法）和 花粉管通道 技术（花粉管通 道法）。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射 技术。此方法的受体细胞多是受精卵 。 将目的基因导入微生物细胞：Ca 处理法。 (四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与 鉴定） 1. 首先要检测转基因生物的染色体DNA 上是否 插入了目的基因 ， 方法是采用 DNA 分子杂交 技术。 2. 其次还要检测目的基因是否转录出 mRNA ，方法是采用 DNA 分子杂交 技术。 3. 最后检测目的基因是否 翻译成蛋白质 ，方法是采用 抗原抗体杂交 技术。 4. 有时还需进行 个体生物学水平 的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。 第二节基因工程的应用 1运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限 。 2基因工程的应用 （1）植物基因工程：抗 虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 （2）动物基因工程： 提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品 品质，用转基因动物生产 药物， 用转基因动物作器官移植的供体等。 （3）基因诊断和基因治疗： 基因诊断：又称为 DNA 诊断，是采用 基因检测 的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病 欢迎阅读 欢迎阅读 原体。 基因治疗：指利用 正常基因 置换或弥补缺陷基因的治疗方法。 实例： ADA 基因缺陷症的基因治疗 第三节蛋白质工程 1蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能 之间的关系，通过 改造基因 ，以定向改造天然蛋 白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。 2蛋白质工程的基本原理 预期蛋白质功能测定蛋白质三维空间结构推测应有的氨基酸 序列找到对应的 脱氧核苷酸 序列（基因）具有预期功能的蛋白质 3. 蛋白质工程的应用 （1）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。 （2）合成嵌合抗体。 （3）改变蛋白质的活性。 蛋白质工程与基因工程区别 蛋白质工程基因工程 实质通过改造基因 ，以定向改造 天然蛋白质，甚至创造自然界不 存在的蛋白质 将目的基因 从供体转移到受体细 胞，并在受体细胞中表达 结果合成自然界 不存在 的蛋白质只能生产自然界 已存在 的蛋白质 联系蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代 基因工程 第二章细胞工程 第一节植物细胞工程 【基础梳理】 一、植物组织培养 1、植物细胞的全能性 （1）生物细胞的全能性 生物体细胞一般都是受精卵经有丝分裂形成，因而都含有生物一整套遗传物质，都具有发育 成完整个体的潜能。 但在生物体上有时不能表现出其全能性，只能通过分化形成不同的组织、 器官， 这是在特定的环境、激素等的影响下基因选择性表达的结果。 （2）植物细胞具有全能性的原因 植物体的全部体细胞都是从受精卵经过有丝分裂产生的，具有发育成完整个体所必需的全套 遗传物质。 （3）细胞表现其全能性的条件 离体、无菌、一定的营养条件、植物激素诱导、环境条件（脱分化避光，再分化需光）。 （4）全能性的大小 受精卵全能性最大； 高度分化的植物细胞具有全能性；高度特化的动物体细胞的全能性受到限 制，它的细胞核仍保持着全能性。 全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞体细胞；植物细胞动物细胞。 2、植物组织培养 欢迎阅读 欢迎阅读 （1）理论基础（原理）： 细胞全能性 （2）核心：脱分化形成愈伤组织和愈伤组织再分化。 （3）过程： （4）培养基的成分 水分、无机盐、碳源、维生素、生长调节剂（细胞分裂素和生长素 ）、有机添加物等。 （5）进行植物组织培养时需要注意的问题 所以实验用具严格灭菌。 接种过程严格的无菌操作。 愈伤组织培养：最初避光培养，后期见光培养。 试管苗培养：先要进行生芽培养，再进行生根培养，试管苗培养要在光照条件下进行。 3、植物组织培养的应用 二、植物细胞培养 （1）概念：在实验室工厂化生产的条件下，将组织培养过程中形成的愈伤组织 或其他易分散的组 织置于液体培养基中， 进行悬浮培养 ，得到分散游离的 悬浮细胞 ，通过继代培养 使细胞增殖， 从而获得大量的 细胞群体 的一种技术。 （2）与植物组织培养的关系 植物 组织 培养是植物细胞培养的基础。 目的不同： 植物组织培养的目的是得到更多的植物体 ，植物细胞培养的目的是获得人类所需的细胞。 （3）实例：成功地培养 红豆杉 的细胞，从中提取出重要的抗肿瘤 药物紫杉醇。 三、植物体细胞杂交技术 1、概念：是将不同种植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞 ，并把杂种细胞培养成新的植物 体的技术。 2、理论基础（原理）： 植物细胞的全能性和细胞膜的流动性。 3、过程 4、注意 （1）去除细胞壁的方法为酶解法：利用纤维素酶和果胶酶 去除植物细胞壁。 （2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激 等。 化学法一般是用 聚乙二醇（ PEG ）作为诱导剂。 （3）原生质体融合后的细胞是杂种细胞 ，利用植物组织培养技术把杂种细胞培养成杂种植株。 （4）融合完成的标志： 杂种细胞再生出细胞壁 ； （5）杂种细胞再生出细胞壁的检测方法：植物细胞的质壁分离与复原。 5、意义： 克服了远缘杂交不亲和的障碍。 第三节动物细胞工程 【基础梳理】 一、动物细胞与组织培养 1、动物细胞培养 （1）植物快速繁殖：优点是取材少，周期短，繁殖率高，便 于自动化管理。 （2）培育无病毒植株：所用材料是植物分生组织（根尖、茎 尖）的生长点细胞 。原因： 分生区极少感染病毒，甚至 无病毒 （3）制造人工种子：取材：胚状体特殊加工：加入某些 农药、微生物、除草剂优点：育种周期短、便于贮藏 和运输缺点：抗菌性差、萌发率低。 欢迎阅读 欢迎阅读 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织 ，将它分散成 单个细胞 ，然后放在适 宜的培养基 中，让这些细胞 生长和繁殖 。 （2）动物细胞培养的过程 （3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上 ，称为 细胞贴壁 。细胞数目不 断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制 时，细胞就会 停止分裂增殖 ，这种现象称为 细 胞的接触抑制 。 （4）原代培养和传代培养 原代培养 : 直接从动物体内取出的组织块，用胰蛋白酶使其分散成单个细胞，然后用培养 基配成一定浓度的细胞悬浮液，转入培养瓶中进行培养的过程。 传代培养：原代培养到一定程度，细胞会出现接触抑制，如果还要继续进行细胞培养，就 要用胰蛋白酶使细胞从甁壁上脱离下来，重新分散成细胞悬浮液， 分装到多个培养瓶中继续培养的 过程。 （5）细胞株和细胞系 细胞株： 原代培养的细胞一般传至10 代左右，细胞的分裂就会出现停滞， 大部分细胞衰老 死亡。但是极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能传代4050 代， 这种传代细胞叫做细胞株。细胞株的细胞的遗传物质没有发生改变。 细胞系： 当细胞传至 50代以后不能再传下去。 但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并 且带有癌变的特点，从而有可能在培养的条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。 （6）所需条件 无菌、无毒的环境 ：培养液应进行 无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素 ，以防 培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞 自身造成危害 。 营养 ：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血 浆等天然成分。 温度 ：适宜温度：哺乳动物多是36.5 0.5 ；pH ：7.2 7.4 。 气体环境 ：95% 空气5% CO2。O2是细胞代谢所必需的， CO 2的主要作用是 维持培养液的 pH 。 （7）动物细胞培养技术的应用 可有助于生产许多有重要价值的生物制品。如制备病毒疫苗、制备单克隆抗体。 可以进行有毒物质和药物的检测。 大面积烧伤或烫伤病人的皮肤移植。 培养医学研究的各种细胞，有助于细胞全能性的揭示、细胞周期及其调控等基础研究的进行。 欢迎阅读 欢迎阅读 2. 动物组织培养 动物细胞培养与动物组织培养方法类似，主要区别是动物细胞培养过程中需要用胰蛋白酶 等使 组织块中的细胞 离散 ，而动物组织培养过程中不需要使用胰蛋白酶 等。 二、细胞核移植技术和动物体细胞克隆 1、概念 :