第一章 蛋白质（Protein）,主要内容：介绍蛋白质的构件单位氨基酸的结构、分类、性质及肽的概念，重点讨论蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互关系。,第一节,蛋白质的组成、分类及生物学功能,蛋白质主要元素组成：C、H、O、N、S 微量元素：P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se 等。,蛋白质平均含N量为16,这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据： 蛋白质含量蛋白质含N量6.25,蛋白质的分类,根据分子形状分类： 根据化学组成分类：,第二节 蛋白质的基本构件单位氨基酸,一、氨基酸的结构通式,-氨基酸的通式,二、氨基酸的分类,非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,（一）氨基酸的分类,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,非极性R基团氨基酸,不带电荷极性R基团氨基酸,带电荷R基团氨基酸,三、氨基酸的性质,(1)两性解离性质和等电点(PI),氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）,pH = pI 净电荷=0,pH pI 净电荷为负,(pK1),(pK2),当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctric point)。,甘氨酸滴定曲线,甘氨酸盐酸盐（A+）,等电点甘氨酸（A）,甘氨酸钠（A-）,谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算,B,（2）氨基酸光学活性,1、氨基酸的旋光性：除甘氨酸外，所有天然-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。 有的是左旋，有的是右旋。,2、紫外吸收光谱：,参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示特征的吸收谱带，最大光吸收（max）分别为280、275、和257nm。 由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。 蛋白质的最大吸收峰一般为:280nm .,Try、Tyr、Phe的 紫外吸收光谱,摩尔吸收系数,波长,（3）氨基酸的重要化学反应,氨基酸与茚三酮反应,+,茚三酮(无色),紫色化合物,氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应 （Sanger反应）,DNFB（dinitrofluorobenzene）,DNP-AA(黄色),+,+ HF,氨基酸,氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应）,PITC（phenylisothiocyanate）,+,苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）,第三节 肽,一、肽及其命名,肽(peptide)是氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水形成的聚合物。 肽的命名是根据肽中所含氨基酸的数目来进行的,由两个氨基酸形成的肽称为二肽,由三个氨基酸形成的肽称三肽,如此类推。 由多个氨基酸组成的肽称为多肽，多肽一般形成链状，常称为肽链( peptide chain) 。,二、肽链的结构,肽单位,肽键,多肽链结构示意图,肽单位,肽基的C、O和N原子间的共振相互作用,共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面 产生键的平均化 肽键呈反式构型,sp2,sp2,sp2,sp3,共振杂化体,三、重要的天然活性肽,类别：激素、抗菌素、辅助因子 实例：谷胱甘肽(glutathione) 短杆菌肽S 促甲状腺素释放因子（TRH）,谷胱甘肽,谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。,短杆菌肽S,Orn: 鸟氨酸,由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促甲状腺素(调节糖代谢)。,第四节 蛋白质的分子结构,蛋白质结构的主要层次,一级结构,四级结构,二级结构,三级结构,primary structure,secondary structure,Tertiary structure,quariernary structure,一、蛋白质的一级结构,多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质的一级结构(primary structure)。 这是蛋白质最基本的结构，它决定蛋白质高级结构和生物功能。,例：牛胰岛素的一级结构,世界三大DNA序列和蛋白质序列的查询资料库：,GenBank http:/www.ncbi.nlm.nih.govl 全称为：the National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine at the National Institutes of Health. govl是指U.S government的一个分支机构。 EMBL http:/www.cbi.ac.uk/ 它位于英国剑桥欧洲生物信息研究所（EBI）。 DDBJ http:/www.ddbj.nig.ac.jp the DNA Data Bank of Japan. 由日本国立遗传学研究所承办。,基本策略： 片段重叠法氨基酸顺序直测法 基本步骤： (1) 蛋白质样品预处理：纯化、测分子量、断开二硫键、断开非共价键。,蛋白质一级结构测定,二硫键的断裂,（2）分析每一条多肽链的氨基酸组成：蛋白质水解+氨基酸自动分析仪使用。 (3)鉴定多肽链N末端、C末端氨基酸残基；,多肽N、C-末端氨基酸的测定,N端 Sanger法（二硝基氟苯反应） DNS法（丹磺酰氯反应） Edman法（苯异硫氰酸脂反应） 氨肽酶法 C端 肼解法 还原法 羧肽酶法,（4）专一性部分裂解多肽链成较小的片段；每种样品至少用两种方法裂解，产生两套以上的片段。,a、胰蛋白酶：水解由Lys or Arg的羧基形成的肽键。 b、胰凝乳蛋白酶：水解由芳香族氨基酸（Phe,Trp or Tyr)的羧基形成的肽键。Leu,Met,His的羧基形成的肽键水解较慢。 Pro的氨基形成的肽键不被水解。,c、嗜热菌蛋白酶：水解疏水性强的氨基酸的氨基形成的肽键。（Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr,or Met) Pro or Gly的氨基形成的肽键不被水解。 d、溴化氰：水解由Met 的羧基形成的肽键。,消化道内几种蛋白酶的专一性,（Phe.Tyr.Trp）,（Arg.Lys）,（脂肪族）,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,弹性蛋白酶,羧肽酶,胰蛋白酶,氨肽酶,羧肽酶,（Phe. Trp）,（5）肽片段的分离纯化 （6）测定各肽段的氨基酸顺序；,氨基酸序列测定,基本方法： Sanger法 Edman降解法 DNS-Edman测序法 蛋白质顺序仪测序,（7）片段重叠法重建完整多肽链一级结构； （8）确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。,蛋白质顺序测定基本方法路线,片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意,所得资料： 氨基末端残基 H 羧基末端残基 S 第一套肽段 第二套肽段 QNS SEQ PS WTQN EQVE VERL RLA APS HQWT HQ,借助重叠肽确定肽段次序：,末端残基 H S 末端肽段 HQWT APS 第一套肽段 HQWT QNS EQVE RLA PS 第二套肽段 HQ WTQN SEQ VERL APS 推断全顺序 HQWTQNSEQ VERLAPS,二、蛋白质的构象和维持构象的作用力,（一）构型与构象 构型（configuration）：立体异构体中取代原子或基团在空间的取向； 一个碳原子和四个不同的基团相连时，只可能有两种不同的空间排列，这两种不同的空间排列叫做不同的构型。这两种构型如果没有共价键的破裂是不能互变的。,构象（conformation）：是指取代基团当单键旋转时可能形成的不同的立体结构。这种空间位置的改变并不涉及共价键的破裂。,（二）维持蛋白质构象的作用力,R基团间的相互作用及稳定蛋白质三维构象的作用力 a.盐键 b.氢键 c.疏水键 d.范得华力 e.二硫键,多肽链,三、蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构（secondary structure）指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元。,（一）肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,酰胺平面与-碳原子的二面角（ 和 ）,二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为定点而旋转，绕C-N键旋转的角度称角，绕C-C键旋转的角度称角。和称作二面角，亦称构象角。 当或旋转使旋转健两侧的主链原子处于顺式构型时，规定=0，或=0。 从C沿健轴的方向观察，顺时针旋转的和角度为（+），逆时针时旋转的为（-）。,完全伸展的多肽主链构象,-碳原子,酰胺平面,=1800，=1800,=00，=00的多肽主链构象,酰胺平面,=00，=00,侧链,非键合原子接触半径,() 螺旋（helix） () 折叠（-pleated sheet） () 转角（-turn） () 无规则卷曲（nonregular coil）,（二）蛋白质二级结构的构象单元,特征：1、 每隔3.6个AA残基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;相邻两个氨基酸残基平移距离为0.15nm。 2 、 螺旋体中所有氨基酸残基R侧链都伸向外侧，链中的全部C=O 和N-H几乎都平行于螺旋轴; 3、每个氨基酸残基的N-H与前面第四个氨基酸残基的C=O形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。,螺旋（helix）,形成因素：与组成和排列顺序直接相关。由于脯氨酸的亚氨基参与形成肽键后，氮原子上已没有氢原子，无法充当氢键供体，致使螺旋中断，产生一个“结节”。 如果肽段内带有相同电荷的残基过于密集，彼此由于同性电荷的排斥，妨碍链内氢键的形成。也会导致螺旋中断。,折叠（-pleated sheet）,特征：两条或多条伸展的多肽链侧向集聚，通过相邻肽链主链上的N-H与C=O之间有规则的氢键，形成锯齿状片层结构，即折叠片。,类别： 平行：N端在同一方向。 =-119，=+113 反平行：N端一顺一反交替排列。 =-139，=+135,转角（-turn）,特征：多肽链中氨基酸残基n的羰基上的氧与残基（n+3）的氮原上的氢之间形成氢键，肽键回折1800 。形成10个原子组成的环。,无规则卷曲示意图,无规则卷曲,细胞色素C的三级结构,超二级结构 (super-secondary structure),在蛋白质分子中，特别是球状蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元（即螺旋、折叠片和转角等）彼此相互作用组合在一起，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件单元，称超二级结构。,超二级结构类型,1 2 3 4 5,5 2 3 4 1, -迂回,回形拓扑结构, -迂回,结构域 (structure domail),是在二级结构和超二级结构基础上形成并相对独立的三级结构局部区域，是空间结构上能辨认的三维实体。,结构域有三种不同而又相互联系的涵义: 1、独立的结构单位 2、独立的功能单位 3、独立的折叠单