2.1微生物的实验室培养一基础知识1.培养基（1）培养基的种类包括 培养基和 培养基等。（2）培养基的化学成分一般都含有 、 、 、 四类营养成分，（3）在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对 、 以及 等的要求。例如：培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加 ；培养霉菌时需要将培养基的PH调至 ；培养细菌时需要将培养基的PH调至 ；培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件2.无菌技术（1）获得纯净培养物的关键是 。避免杂菌污染的方法主要包括以下四个内容： （2）消毒是指 灭菌是指 （3）实验室常用的消毒方法是 ，此外，人们也常使用化学药剂进行消毒，如用 、 等。常用的灭菌方法有 、 、 ，此外，实验室里还用 或 进行消毒。二实验操作1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤： 倒平板（2）倒平板的过程待培养基冷却至 左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：在火焰旁右手拿 ，左手 ；使锥形瓶的瓶口 ；左手将培养皿 ，右手 ，立刻盖上皿盖。待平板冷却凝固后，将平板 。2.纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法中最常用的是 和 。1平板划线法是 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。其操作步骤是：将 在酒精灯火焰上灼烧直至 。在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。将菌种试管口通过火焰达到 的目的。将冷却的接种环伸入到 。将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将 ，盖上皿盖，不要划破培养基。灼烧接种环，冷却后从 划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将 相连。将平板 培养。2稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的 ，然后将 进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的 。系列稀释操作：取盛有 mL水的无菌试管6支 ，编号101、102、103、104、105、106。用灼烧冷却的移液管吸取 mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次使之混匀。从101倍液中吸取 mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。三课题延伸菌种的保存为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。对于频繁使用的菌种，我们可以采用 法；对于需要长期保存的菌种，可以采用 法。2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1尿素只有被 分解成 之后，才能被植物吸收利用。2以土壤中能分解尿素的细菌为研究对象，要达到的两个主要目的是： ； 。3PCR（ ）是一种在体外将 。此项技术的自动化，要求使用耐高温的DNA聚合酶。4实验室中微生物的筛选应用的原理是：人为提供有利于 生长的条件（包括 等），同时 其他微生物生长。5选择培养基是指 。6常用来统计样品中活菌数目的方法是 。即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。另外， 也是测定微生物数量的常用方法。8一般来说，统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。这是因为 。因此，统计结果一般用 而不是活菌数来表示。9设置对照实验的主要目的是 ，提高实验结果的可信度。10对照实验是 。11实验设计包括的内容有： 、 、 和 ，具体的实验步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。12样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用 ，测定放线菌的数量，一般选用 ，测定真菌的数量，一般选用 13微生物的培养与观察，不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养 。14无菌操作应注意什么问题？取土样的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要 。应在 。在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在 。15对所需的微生物进行初步筛选，只是分离纯化菌种的第一步，要对分离的菌种进行一步的鉴定，还需要借助 的方法。2.1 液体 固体 水 碳源 氮源 无机盐 pH 特殊营养物质 氧气 维生素 酸性 中性或微碱性 防止外来杂菌的入侵 对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 煮沸消毒法 酒精擦拭双手 用氯气消毒水源 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。 紫外线 化学药物 计算 称量 溶化 灭菌 50装有培养基的锥形瓶 拔出棉塞 迅速通过火焰 打开一条稍大于瓶口的缝隙 将锥形瓶中的培养基（约1020mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖 倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上 平板划线法 稀释涂布平板法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线 接种环 接种环烧红 菌液中蘸取一环菌液 沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线 第一区域划线的末端开始往第二区域内 最后一区的划线与第一区相连 梯度稀释 同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面 单个菌落 9 灭菌 1 1 临时保藏 甘油管藏2.2细菌 氨 从土壤中分离出能够尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟有多少这样的细菌DNA多聚酶链式反应 少量DNA大量复制的技术 目的菌株 营养、温度、pH 抑制或阻止 将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 稀释涂布平板法 一个活菌 30300 显微镜直接计数 低 当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的是一个菌落 菌落数 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果 实验方案 所需仪器 材料用具 药品 104 105 106 103 104 105 102 103 104 温度 时间 灭菌 火焰旁称取土壤 火焰旁操作 生物化学 4