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BCA测蛋白的具体操作步骤精品文档一. 原理 BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成,实现了蛋白浓度测定的简单,高稳定性,高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25 微克/毫升,最小检测蛋白量达到0.5微克,待测样品体积为120微升。 二. 试剂盒组份 组 份 Cat: KGPBCA (250 assay酶标板/50assay 1mL比色杯) 蛋白标准溶液(0. 5 g/L ) 5 mL BCA试剂A 25 mL2 BCA试剂B 1mL 三. 操作步骤 A 酶标板操作 1. 标准曲线的绘制:取一块酶标板,按照下表加入试剂 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液(L) 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水(L) 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量(g) 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0孔号01234567蛋白质溶液(L)01248121620去离子水(L)2019181612840相应蛋白质含量(g)00.51246810 2. 根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀;3. 各孔加入200L BCA工作液; 4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec,37放置30分钟,然后在562nm下比色测定。以蛋白含量(g)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线;5. 稀释待测样品至合适浓度,使样品稀释液总体积为20L,加入BCA工作液200L,充分混匀,37放置30分钟后,以标准曲线0号管做参比,在 562nm波长下比色,记录吸光值; 6. 根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(g),除以样品稀释液总体积(20L),乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单 位:g/L)。 B 分光光度计测定 1. 标准曲线的绘制:各管按照下表加入试剂 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液(L) 0 5 10 20 40 60 80 100 去离子水(L) 100 95 90 80 60 40 20 0 对应蛋白含量(g) 0 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 2. 根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀; 3. 各管加入1000L BCA工作液;4. 各管充分混匀,37放置30分钟,然后在562nm下比色测定。以蛋白含量(g)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线; 5. 稀释待测样品至合适浓度,样品稀释液总体积为100L,加入BCA工作液1000L,充分混匀,37放置30分钟后,以标准曲线0号管做参比,在 562nm波长下比色,记录吸光值; 6. 根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(g),除以样品稀释液总体积(100L),乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单 位:g/L)。 四. 注意事项 1. 配制好的混合BCA工作液室温24小时内稳定。 2. 加入BCA工作液后,也可以在室温放置2小时,或60放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升 高而加快。如果浓度较低,适合在较高温度孵育,或延长孵育时间。 3. 待测样品浓度在502000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。 4. BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响,需确保EDTA低于10mM,无EGTA,二硫苏糖醇低于1mM,-巯基乙醇低于1mM.不适用BCA法时 建议使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。 5. 操作时要带手套。五、储存BCA 试剂A 和BCA 试剂B 室温保存,蛋白标准液-20冻存。收集于网络,如有侵权请联系管理员删除
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