第四章 荧光分析法 一、分子荧光分析理论基础 （一）概述 处于分子基态单重态中的电子对（自旋方向相反）中一个电子被激发，跃迁至激发单重态轨道上，再从第一激发态最低振动能级返回基态的各振动能级时发射荧光。,S,T,分子基态 激发态,+ h (吸收辐射),- h,分子基态,荧光,第四章 荧光分析法 一、分子荧光分析理论基础 （一）概述 处于分子基态单重态中的电子对（自旋方向相反）中一个电子被激发，跃迁至激发单重态轨道上，再从第一激发态最低振动能级返回基态的各振动能级时发射荧光。,（二）激发光谱和荧光光谱 1激发光谱：固定某一发射光波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱，得到荧光激发光谱。 2.荧光光谱：固定某一激发光波长，测定荧光发射强度随发射波长变化的光谱，得到荧光光谱。,荧光光谱的特点： 1、斯托克斯位移(stokes shift)：与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处。 2、荧光发射光谱与激发波长无关。 3发光量子产率（F）：定义为发光物质发射的光子数与吸收的激发光光子数之比。 F=发射的光子数/吸收的光子数。,（三）影响物质发光的因素 1分子结构与荧光 (1)共轭度大，发射波长红移，发光强度增加。 (2)刚性平面性结构分子荧光量子产率高。,联苯 芴,F=0.2 F=1.0,F=0.11 F=0.29,em=278nm em=321nm,2取代基的影响 给电子基团(-OH、-NH2等)增加荧光强度。 吸电子基团(-COOH、-NO2等)降低荧光强度。 3溶剂的影响 溶剂极性越大，增加荧光强度。 4温度的影响 温度越高，降低荧光强度,（四）荧光定量关系式 稀溶液的荧光强度与浓度成正比： If =2.3 I0 lc 当入射光强度I0 和l 一定时， If = K c （K为常数）,荧光分析法的特点：灵敏度高，发光参数多，可进行动力学分析，分析线性范围比吸收光谱法宽，选择性比吸收光谱法好。但荧光寿命约为10-8秒。,二、荧光分析在医学中的应用 痕量分析： If =2.3 I0 lc= K c 使用激光光源，荧光定量分析的灵敏度甚至可达10-14 mol/l。使用激光光源的荧光分析法又称激光诱导荧光。,DNA荧光发光探针： 荧光探针在发光分析中应用广泛。 DNA （生命遗传的重要物质）分子的定量分析和特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。 但生物分子自身的荧光较弱，目前多采用荧光探针法检测。 荧光探针法较传统的同位素检测速度快，重复性好，用样量少，无辐射，在DNA 自动测序、抗体免疫分析、疾病诊断、抗癌药物分析等方面已得到广泛应用。 目前DNA 荧光探针的研究热点： （1）灵敏度（2）避免生物荧光背景的干扰,吖啶类荧光探针 吖啶类染料是应用最早的核酸荧光探针。 机理：通过嵌入或静电吸引与DNA 分子结合，使DNA 的荧光大大增强。 吖啶的基本结构为二苯并吡啶，在水溶液中呈弱碱性。 1940 年，发现当吖啶橙与酸性物质连接或存在于酸性物质中时，其特征光谱会发生一定的变化，开始被用于生物体的染色。,吖啶橙可与DNA 或RNA 作用，与双链DNA结合后，荧光激发/发射波长为502/538nm。 为提高染料稳定性及荧光强度，大量的吖啶衍生物被合成。 1、10-羧甲基吖啶酯，其荧光及稳定性都有很大提高，同时含有的羧基活性基可与生物分子共价结合。 2、吖啶的络合物，会对DNA 序列特异识别，有望成为DNA 的转录抑制剂，控制核酸的表达。,荧光素类荧光探针 荧光素1 ：1871 年由Von Bayer 合成， 最大吸收/发射：492/571 nm (水中)，量子产率0.92。由于荧光强度大，大量的荧光素衍生物被合成并用作荧光检测试剂：荧光素2、3、4是应用最广泛的荧光衍生试剂，用于病毒学、细胞学及免疫组织化学。如将荧光素共价连接到核酸、寡核苷酸、药物、蛋白质及其它分子来合成探针，可用于基因病毒的检测及表达。,分子取向测定： 通过荧光偏振的测定，可以获得分子取向等结构信息。 荧光偏振度：P=(Iz-Ix)/(Iz+Ix) Iz, Ix分别代表起偏器和检偏器方向相互垂直和平行时测得的荧光强度。 荧光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比，荧光体越小，转动速度越快，其偏振度越小。 当小分子荧光体连接到大分子蛋白质或抗体后， 分子转动速度变慢，偏振度增大。荧光偏振可用于免疫检测。,