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第五章 核酸的分离纯化,核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础; 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。,第五章 核酸的分离纯化,DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子,是分子生物学和分子诊断的研究对象。 DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。,第五章 核酸的分离纯化,核酸分离纯化的原则 一、 保持核酸一级结构的完整性 二 、尽可能提高核酸制品的纯度,第五章 核酸的分离纯化,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,第二节 基因组DNA的分离纯化,第三节 质粒DNA的提取与纯化,第四节 RNA的分离纯化,第五章 核酸的分离纯化,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,一、材料与方法的选择,二、技术路线的设计,三、核酸的鉴定与保存,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,一、材料与方法的选择,(一) 材料与方法的选择,(二) 选择原则,(一) 材料与方法的选择,不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求 需考虑制备核酸所需的时间与成本 应选择安全的试剂与制备方案,一、材料与方法的选择,1、保持核酸碱基序列的完整性 2、尽量清除其它分子的污染,保证核酸纯度 3、保持核酸的完整性 应尽量简化分离纯化步骤,缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏,(二) 选择原则,一、材料与方法的选择,二、技术路线的设计,(一)核酸的释放,(二)核酸的分离与纯化,(三)核酸的浓缩、沉淀与洗涤,(一)核酸的释放,DNA和RNA均位于细胞内(病毒除外),因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。,二、技术路线的设计,表- 各种组织细胞破碎方法,核酸分子抽提的技术设计,核酸的释放: 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法(非机械法中溶胞法是应 用最广泛的方法) 核酸的分离与纯化: 将含有核酸分子复杂复合物中,将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物(蛋白质、多糖和脂 类分子)、非需要的核酸分子、试剂和溶液,应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物:蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子:分离某一特定的核酸分子 时,其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子,(二)核酸的分离与纯化,二、技术路线的设计,(三)核酸的浓缩、沉淀与洗涤,沉淀是浓缩核酸的最常用的方法 常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁 常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐,需用70%75%的乙醇洗涤去除,二、技术路线的设计,三、核酸的鉴定与保存,(一)核酸的鉴定,(二)核酸的保存,(一)核酸的鉴定,1、浓度鉴定,2、纯度鉴定,3、完整性鉴定,三、核酸的鉴定与保存, 紫外分光光度法:该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线,其最大吸收波长为260nm。,1、浓度鉴定,三、核酸的鉴定与保存,各种碱基的紫外吸收光谱,三、核酸的鉴定与保存,荧光光度法:核酸的荧光染料溴化乙锭嵌 入碱基平面后,本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光,且荧光强度的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。,三、核酸的鉴定与保存,EB与DNA的结合, 紫外分光光度法:该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染,比值升高与 降低均提示不纯。 在TE缓冲液中,纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.0,2、纯度鉴定,三、核酸的鉴定与保存,1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA(或RNA) 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,三、核酸的鉴定与保存,浓度鉴定,紫外分光光度法:测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260稀释倍数50 g/ml 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,(A值等于1时,相当于50g/ml双链DNA, 40g/ml单链DNA或RNA,20 g/ml单链寡核苷酸),荧光光度法:用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多,电泳迁移率低。,三、核酸的鉴定与保存,荧光光度法 荧光染料溴化乙锭,可嵌入到碱基平面,而发出荧光,且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。(1-5ng), 琼脂糖凝胶电泳法: 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可 判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段 的分子量很大,在电场中泳动很慢,如果 发生降解,电泳图呈拖尾状。,3、完整性鉴定,三、核酸的鉴定与保存,DNA片段的降解,三、核酸的鉴定与保存,完整或降解很少的总RNA电泳图谱中,三条带荧光强度积分应呈特定的比值,沉降系数大的核酸区带,电泳迁移低,荧光强度积分高;反之,分子量小,电泳迁移率高,荧光强度积分低。,三、核酸的鉴定与保存,一般而言,28S(23S)RNA的荧光强度约为18S(16S)RNA的2倍,否则提示有RNA的降解。若 在点样孔附近有着色条带,则说明存在DNA 的污染。,三、核酸的鉴定与保存,总RNA电泳图谱,三、核酸的鉴定与保存,正常时,28S RNA的荧光强度约为18S RNA的2倍,否则提示RNA的降解,(二)核酸的保存,1、DNA的储存,2、RNA的储存,三、核酸的鉴定与保存,1、短期贮存: 4或-20存放于TE(tris和EDTA)缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关,PH为8时,可减少DNA脱氨反应,PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存: TE缓冲液中-70保存数年;在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,三、核酸的鉴定与保存,(二)核酸的保存,_DNA的储存,2、RNA的储存,RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中,-70 保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液 中加入RNasin或VRC,保存时间可延长。,三、核酸的鉴定与保存,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,一、酚抽提法,二、甲酰胺解聚法,三、玻棒缠绕法,四、其它方法,五、DNA片段的纯化,六、DNA片段的回收,DNA酚抽提法示意图,一、酚抽提法,一、酚抽提法,该法于1976年由Stafford及其同事创立,现在使用的是改进的方法 以含EDTA、SDS及RNase裂解缓冲液裂解细胞 经蛋白酶K处理后,用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA,获得DNA粗制品,DNA样品准备,常见的标本: 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织: 最好新鲜组织,若不能马上提取,应贮存 70或液氮,主要试剂的作用: EDTA:1 二价金属螯合剂,抑制核酸酶; 2 降低细胞膜的稳定性,SDS的作用: 1 溶解膜蛋白和脂肪,从而是细胞膜破裂; 溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸 释放出来; 3 对RNA、DNA酶有抑制作用; 4 与蛋白质形成R-O-SO3 .R蛋白质复合物,使蛋白质变性。,蛋白酶K: 水解蛋白质的作用,消化DNA酶和细胞中的蛋白质。 蛋白酶K与其他蛋白酶相比,它具有更强的水解能 力,而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性,可 同时使用。,酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。 PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入水相,减少在蛋白质层滞留。 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇,是可以减少实验中的气泡的产生,而且利于分相,保持分相的稳定性。,为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离?,苯酚在空气中经常被氧化生成醌,它能够产生自由基,直接用于DNA分离,会使磷酸二酯键断裂,造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物,并用Ttis-Hcl饱和酚,并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液,降低DNA的损失率。,DNA的沉淀,1.无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子,作用是中和核酸分子表面的负电荷,有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水,使DNA沉淀析出,无水乙醇使用前冰冻,可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。 2.异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外,还可以溶解少量的小的RNA分子。,DNA的浓缩,1、固体聚乙二醇(PEG)浓缩:用透析袋外敷PEG至合适量。 2、丁醇抽提浓缩:DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇,但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。,DNA的检测,溴乙锭染色 :在254nm紫外光下检测,如需回收最好在300nm紫外光下割胶,否则易使嘌呤断链,在1cm宽带上可检到10ng DNA。 银染法 :Ag+与DNA形成复合物,在甲醛还原下可染成黑褐色,灵敏度高200倍,但不能回收。,二、甲酰胺解聚法,1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法,其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法,但不进行酚的抽提。,破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物,可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右,三、玻棒缠绕法,现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改进而来。,DNA玻棒缠绕法示意图,三、玻棒缠绕法,四、其它方法,常用的一些分子诊断技术,并不需要高分子量的DNA样品,因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法运用而生并广泛使用 1.异丙醇沉淀法:仅用二倍容积异丙醇替代乙醇,可去除小分子RNA(在异丙醇中可溶状态) 2.玻璃珠吸附法,五、 DNA片段的纯化,常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法(column chromatography),DNA柱层析法示意图,五、 DNA片段的纯化,六、 DNA片段的回收,原则与要求: 1.提高片段的回收率; 2.清除回收的DNA样品中的杂质。,六、 DNA片段的回收,(二) 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段,(一) 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法,(一) 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,六、 DNA片段的回收,电泳到DEAE-纤维素膜 : DEAE是一种阴离子交换纤维素,可以吸附带有负电荷的DNA分子。 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜,继续电泳至条带DNA都到膜上,取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好,纯度高。但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。,透析袋电洗脱 : 切下条带的琼脂糖凝胶,放透析袋内,加缓冲液后继续电泳,DNA出胶后进行抽提DNA回收。,低熔点琼脂糖凝胶: 切下胶,加热到65熔化胶,然后抽提回收DNA。 方法:有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。,玻璃珠洗脱法:将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液,然后加入玻璃珠结合DNA,经分离、洗涤后,在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。,琼脂水解酶:将含DNA的凝胶进行消化,琼脂糖水解成二糖,释放DNA,后使用酚抽提方法回收DNA,(二) 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段,
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