SZBC 核酸实验室污染原因分析及污染控制对策核酸实验室污染原因分析及污染控制对策 深圳市血液中心检验科深圳市血液中心检验科 曾劲峰曾劲峰 SZBC 行政主管部门颁布文件行政主管部门颁布文件 临床基因扩增实验室管理暂行办法 医疗机构临床扩增实验室管理办法 血站核酸检测实验室质量保证指南 血站核酸检测(NAT)实验室是具有特殊安全要求的工作场所 极微量的污染即可导致假阳性结果 保障血液安全（输血安全） 保护献血资源（献血安全） SZBC 为何要为何要高度重视核酸实验室高度重视核酸实验室环境环境 污染并制订应对策略污染并制订应对策略 PCR 核核 酸酸 检检 测测 技技 术术 （nucleic acid amplification testing, NAT）包括两种扩增方式： 1.聚合酶链锁反应法聚合酶链锁反应法（Polymerase chain reaction，PCR) 2.转录介导的扩增方法转录介导的扩增方法(transcription mediated amplification,TMA) 核核 酸酸 检检 测测 技技 术术 TMA 目前核酸检测（NAT）已经在输血安全血液筛查方面发挥着越来越大的 作用。但是由于其敏感性极高,微量的污染将造成实验失败. 全国全国4040余家余家 检测数量检测数量300300万人份万人份 SZBC 目目 录录 影响影响NATNAT实验室污染原因实验室污染原因 1 实验室污染的判断和预防实验室污染的判断和预防 2 核酸实验室污染的消除核酸实验室污染的消除 3 核酸实验室污染的监控及对策核酸实验室污染的监控及对策 4 SZBC 影响影响NAT实验室污染原因实验室污染原因 一 核核 酸酸 实实 验验 室室 设备污染设备污染 标本阳性率异常增高标本阳性率异常增高 阴性对照出现阳性阴性对照出现阳性 其其 他他 污污 染染 产产 物物 污污 染染 试试 剂剂 污污 染染 标标 本本 污污 染染 SZBC 核酸实验室污染核酸实验室污染原因原因 一 标本容器被污染标本容器被污染 标本放置时标本放置时, , 由于密封不严溢于容由于密封不严溢于容 器外器外 标本核酸模板在提取过程中，由于标本核酸模板在提取过程中，由于 操作导致标本间污染操作导致标本间污染 在进行标本处理时，病毒可随气溶在进行标本处理时，病毒可随气溶 胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此 间的污染间的污染 标本污染 试剂污染 试剂处理配制过程中试剂处理配制过程中 移液器移液器 容器容器 实验用水实验用水 或储存不当或储存不当 SZBC 核酸实验室污染核酸实验室污染原因原因 一 产物污染产物污染- -最主要最常见最主要最常见 极微量的扩增产物污染极微量的扩增产物污染, , 就可形成就可形成 假阳性。假阳性。 （产物来源可能来源于设备内部，（产物来源可能来源于设备内部， 或实验室外部实验活动产生的污或实验室外部实验活动产生的污 染）。染）。 产物污染 其他污染 实验室中克隆质粒的污染实验室中克隆质粒的污染 分子生物学实验室及用克隆质粒做分子生物学实验室及用克隆质粒做 阳性对照的检验室，这个问题也比阳性对照的检验室，这个问题也比 较常见较常见 克隆质粒在单位容积内含量浓度高克隆质粒在单位容积内含量浓度高 其污染可能性也很大其污染可能性也很大 SZBC 核酸实验室污染核酸实验室污染的判断和预防的判断和预防 二 阳性标本数量异常增高 v 渐进式 (假阳性日益增多） v 散发式（假阳性样品不定期增多） v 突发式 (假阳性样品突然增多) 阴性对照出现阳性反应 实验室污染的表现形式 SZBC 核酸实验室污染核酸实验室污染的判断和预防的判断和预防 二 定期统计实验室阳性数量 SZBC 核酸实验室污染核酸实验室污染的判断和预防的判断和预防 二 可能存在的污染情况 试剂污染试剂污染 ( (更换新的试剂重新检测评估更换新的试剂重新检测评估) ) 标本污染标本污染 ( (重新采样进行检测重新采样进行检测, ,评估标本前处理环节评估标本前处理环节) ) 设备污染设备污染 ( (设备整体消毒清洁设备整体消毒清洁 维护维护) ) 产物污染产物污染 （全面清洁消毒实验室、仪器设备所有实验有关用品）（全面清洁消毒实验室、仪器设备所有实验有关用品） 针对可能发生的污染情况有的放矢针对可能发生的污染情况有的放矢 SZBC 核酸实验室污染核酸实验室污染的判断和预防的判断和预防 二 合理的核酸实验室分区合理的核酸实验室分区 合格的实验操作人员合格的实验操作人员 合适的检测试剂和检测平台合适的检测试剂和检测平台 严谨、科学的质量管理体系严谨、科学的质量管理体系 完善的实验室环境监控措施完善的实验室环境监控措施 SZBC 完备的实验室配套设施完备的实验室配套设施 血筛核酸实验室仪器设备特点血筛核酸实验室仪器设备特点 ： 高自动化高自动化 高检测通量高检测通量 高信息化高信息化 提供良好条件预防实验室的污染提供良好条件预防实验室的污染 严格的管理严格的管理-可操作性的可操作性的SOP 严格控制进出实验室的人员严格控制进出实验室的人员。严格执行严格执行核酸实验室设置与管理规核酸实验室设置与管理规 范范的管理的管理 ； 尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性；尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性； 核酸实验室医疗废物按核酸实验室医疗废物按医疗废物管理程序医疗废物管理程序执行执行。废液不能在实废液不能在实 验室中倾倒验室中倾倒。 扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别应特别 注意实验人员的安全防护注意实验人员的安全防护。 SZBC 将样品和标准品将样品和标准品、对照品去掉盖子对照品去掉盖子，按照工作列表插入样按照工作列表插入样 品架避免交叉污染；品架避免交叉污染； 实验中须使用一次性手套实验中须使用一次性手套，手套在实验过程中疑有污染应手套在实验过程中疑有污染应 立即更换立即更换，每个区的物品均有明确标示每个区的物品均有明确标示，各室物品不得混各室物品不得混 用用。 避免因不能戴上手套而用手反复搓揉手套或用口吹胀手套避免因不能戴上手套而用手反复搓揉手套或用口吹胀手套 的行为；的行为； 实验人员经过全国血液病毒核酸检测培训班培训并取得实验人员经过全国血液病毒核酸检测培训班培训并取得 上岗证；上岗证； 每天清洁一遍工作台面每天清洁一遍工作台面，每月彻底维护清洁一遍检测系统每月彻底维护清洁一遍检测系统 （包括分析仪包括分析仪，电脑电脑）； 规范的预防措施规范的预防措施 SZBC 核酸实验室污染核酸实验室污染的判断和预防的判断和预防 二 预防为主，严守规程预防为主，严守规程 SZBC SZBC 细致的工作流程细致的工作流程 正确的上样方式。正确的上样方式。 正确的试剂装载方式正确的试剂装载方式 正确的仪器设备维护方式正确的仪器设备维护方式 正确的医疗废物处理方式正确的医疗废物处理方式 规范的预防措施规范的预防措施 SZBC SZBC 封闭的实验环境 方便快捷的试剂装载 试剂分配区、样本分配区相互隔离 扩增反应管的密封性能 实验废弃物收集区相对隔离 查找可疑污染源查找可疑污染源 1 1) )回顾检查试剂的存回顾检查试剂的存 放和使用过程放和使用过程 2 2) )设备有无存在污染设备有无存在污染 物外泄物外泄。 3 3) )排查是否为扩增产排查是否为扩增产 物污染物污染 4 4）评估标本是否处理评估标本是否处理 不当不当 5 5) )环境是否受到外来环境是否受到外来 性的污染性的污染。 1 1）更换新的试剂更换新的试剂 2 2）到其他核酸实到其他核酸实 验室验证试剂是否验室验证试剂是否 污染污染 3 3）更换核酸实验更换核酸实验 室所有耗材：记号室所有耗材：记号 笔笔，记录本记录本，甚至甚至 拖把等等拖把等等 1 1）实验台面实验台面、超净工作超净工作 台用现配的台用现配的3 3% %双氧水或次双氧水或次 氯酸钠溶液擦拭清洁氯酸钠溶液擦拭清洁 2 2）用用1010% %漂白粉溶液擦漂白粉溶液擦 拭拭 3 3）紫外光照射紫外光照射，照射距照射距 离应不超过离应不超过9090 cmcm，照射照射 时间最好过夜时间最好过夜 4 4）通风通风 更换试剂、耗材更换试剂、耗材 清洁所有可能污染源清洁所有可能污染源 核酸实验室污染核酸实验室污染的消除的消除 三 研究证明，紫外线照射、84 消毒液是清除实验室外源性DNA 污染的 有效方法；过氧乙酸消毒液、次氯酸钠溶液和戊二醛消毒液。 SZBC 经过空气下落法取样追踪实验，结果是阳性，推断污染可经过空气下落法取样追踪实验，结果是阳性，推断污染可 能是由空气中能是由空气中PCRPCR产物的气溶胶造成的。若所有处理后连续产物的气溶胶造成的。若所有处理后连续 三次仍为阳性三次仍为阳性 更换实验场所更换实验场所 核酸检测 1) 空气下落法取样 在每个取样点放置3个样品管， 每管4ml 生理盐水暴露放置1 h 后， 进行核酸检测 2) 物体表面擦拭法取样 用5cm5cm标准涂擦法，用浸有生理盐水的棉拭子按照上述标准横竖 往返均匀涂擦5次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子 放入无菌的 4 ml 生理盐水试管内浸泡 30min 后弃棉拭子，对棉拭子 浸泡液进行核酸检测 SZBC 标本污染实验室台面后，用纸巾初步清洁台面，然后用84消毒原液清洗， 用去离子水清洁。 使用75%的酒精清洁污染处。 停止使用被污染的工作台，按可移动紫外线灯标准操作规程进行紫外 消毒。 每天0.584消毒液清洁地面。 标本污染的紧急处理标本污染的紧急处理 SZBC 清洁实验室墙面、地面、工作台面。 对空气用紫外灯进行消毒 清理工作台面多余的物品（如文件盒、文具、各种与实验无关 的物品）。 检查更换空调滤网、对空调、天花板进行清洁消毒。 检查各实验室间的空气流通是否独立。 定期（每周一次）消毒离心机、离心杯、上样试管架。 实验室环境污染的处理实验室环境污染的处理 SZBC 核酸实验室污染核酸实验室污染的监控及对策的监控及对策 四 对照质控成功对照质控成功 可重复性可重复性 血液筛查核酸实验室血液筛查核酸实验室每月至少实施暴露表面有无核酸扩增产每月至少实施暴露表面有无核酸扩增产 物污染的监测物污染的监测 设备表面设备表面 工作台面工作台面 辅助设备辅助设备（手推车手推车、试剂摇摆移等试剂摇摆移等） SZBC 污染清除后的确认 对一定数量的个阴性标本或盐水（90个） 进行检测，结果均为阴性 SZBC 试管架的浸泡消毒 SZBC SZBC SZBC SZBC 好的核酸实验室好的核酸实验室，要时刻注意污染的监测并制订有要时刻注意污染的监测并制订有 效的防范机制效的防范机制 有无污染有无污染？ 什么原因造成的污染什么原因造成的污染？ 采取什么措施采取什么措施，防止和消除污染防止和消除污染？ 实验室污染的监控实验室污染的监控 SZBC