啤酒酵母选育项目紫外诱变及其突变株的性能测试1材料与方法1.1材料菌种：四铃啤酒酵母仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）1.2试验方法1.2.1酵母菌的活化取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养，于28恒温培养箱培养14h，得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液。然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采用28恒温培养14h，得到完全活化的正常生长的酵母菌。 1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定1.2.2.1菌悬液的制备取1OmL菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于1OmL生理盐水中，制得菌悬液。取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中，摇匀，130r/min振荡培养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦芽汁培养液为对比，根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。（此图视为参考）1.2.3紫外线诱变试验用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度达到lx106个mL。(此处菌悬液浓度的确定采用三种方法：1.显微镜直接计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法)备注：平板直接计数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落，且培养周期长，耗时多，工作量大，但是也是我们的强项，可以锻炼大一的动手能力。2：显微镜直接计数法：比较直观，我们可以直接显微观察，多人工作计数。耗时较短，且工作量较小，并且我系其他实验组采用此方法计数，可供参考。3：光电比浊法：虽然绘制标准曲线要求较高，但是工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后可以用，准确率较高。比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，可以校正方案。实验步骤：打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳定。1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀，28活化培养14h。2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液加入4mL生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min左右，重复2次，制成5mL悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，调整细胞浓度。3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释，分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板，约为10-3、10-4、10-5，每一个梯度3个平板，每一个平板加0.2mL菌液，进行培养后平板计数法，作为对照。4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入一无菌磁力转子，置于磁力搅拌器上。5 30W紫外灯下30cm处照射，调整照射时间。本次预设为0，30，45，60，90，120，180，600.（单位s）6取一定稀释梯度的紫外照射菌液0.1（视具体情况而定）用无菌涂布棒涂布均匀，每组做三个平行线培养记录菌落数，计算各照射时间下的致死率。（选在75%-80%）。致死率=未经照射菌落数-紫外照射菌落数未经紫外照射菌落数7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养，然后重复1-5，再重复第5步，挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养，连续进行5次，28培养20h左右，计算其突变率和致死率。（上述时间等数字视为参考数值）1.2.3.1初筛诱变后挑选在麦芽汁固体培养基上生长良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。1.2.3.2复筛供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵，测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。双乙酰含量测定：初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml 120Bx麦芽汁发酵8d后，测定发酵液中的双乙酰含量，选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵，将双乙酰含量明显降低的4 株菌分别编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3 和FB-E4 。结果见表1 表1 发酵液中双乙酰含量的比较菌株 F B FB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4双乙酰含量 (mg/L) 0.1233 0.0706 0.0926 0.0776 0.0870降低率(%) 0 42.7 24.9 37.1 29.4（此处绘制表格样式视为参考）双乙酰代谢的控制：1. 降低前驱物质-乙酰乳酸的生产量措施：改良酵母菌种 提高麦汁中-氨基氮含量，可以抑制合成酶的活性2加速双乙酰的还原措施：提高酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量）提高还原温度（封罐后高温还原）限制后期酵母的出芽率（封罐）国标中对于啤酒中双乙酰的量的要求二级啤酒：0.2mg/L 一级啤酒：0.13mg/L方法：国标GB4927-2001检测培养条件：恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。原理：双乙酰的测定方法采用比色法。邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法，所以，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量，结果偏高。但此法快速简便。用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯二胺，形成2，3二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸收峰，可进行定量测定。1仪器：带有加热套管的双乙酰蒸馏器，蒸汽发生瓶（2000mL或3000mL）或者锥形瓶，平底烧瓶，容量瓶25mL2试剂和溶液盐酸溶液（4moL/L），邻苯二铵溶液：10g/L（称取邻苯二铵0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10mL摇匀，放于阴暗处，注意此溶液即用即配）消泡剂 3实验步骤(1)把双乙酰蒸馏器安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。(2)将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下，使出口尖端浸没在水面下，外加冰水冷却。(3)加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套，备用。(4)于100mL量筒中加入24滴消泡剂，再注入5左右未除气啤酒100mL。(5)待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸馏器内，再用约10mL蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子，用水封口。(6)待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，到馏出液接近25mL时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀(蒸馏应在3分钟内完成)。(7)分别吸取馏出液10mL于两支比色管中。一管作为样品管加入0.5mL邻苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20-30分钟，然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液，于空白管中加2.5mL4N盐酸溶掖，混匀。(8)在335nm波长处，用1cm比色皿以空白作对照测定样品吸光度。(9)计算：双乙酰(mgL)A3352.4（用20mm石英比色皿时，吸光度与双乙酰的换算系数）注：若用20mm的石英比色皿则换算系数则为1.21.2.4不同菌株的发酵性能测试（CO2失重法）将发酵摇瓶置于26度恒温环境中，每天称重1次（直至日失重小于0.5g为止），因每瓶用于发酵的麦芽汁体积相同，所以只需计算发酵后单位时间内CO2的释放量，发酵6d，以CO2 产生量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制C02产生量曲线。1.2.6不同菌株发酵发酵液中残留总糖含量测定从8个发酵后的发酵瓶中各取0.2mL发酵液并稀释500倍，用硫酸-苯酚法测定发酵液中残留总糖的含量。附录：硫酸-苯酚法1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg，蒸馏水准确定容500mL得到0.04mg/L的葡萄糖液。2）试剂1）浓硫酸：分析纯，95.5%2）80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。3）6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）4）15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。5）5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。6）6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。7）6mol/L盐酸表1 标准曲线的制作步骤管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8葡萄糖 0.0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8蒸馏水 2.0 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2苯酚液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0浓硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0取8支干净的具塞试管按表2方法操作,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。1制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。2样品含量测定：取样品1克（湿样）加1mL15%TCA（三氯醋酸）溶液研磨，再加少许5TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96水浴锅中水浴2小时。定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。1.2.7不同菌株产酒精能力（酒精度）测试快速氧化法乙醇在酸性条件下,经过量的、一定浓度的重铬酸钾作用，氧化生成醋酸。再将剩余的的重铬酸钾经硫代硫酸钠还原。由反应过程中，通过消耗的硫代硫酸钠的量计算酒精含量。试剂：重铬酸钾溶液、硝酸溶液、碱性碘化钾溶液、淀粉溶液、硫代硫酸钠标准溶液方法：在蒸馏器的接收瓶中，加入10.00ml重铬酸钾溶液和25ml硝酸溶液。并将空气冷凝器的出口插入此溶液中。在蒸馏瓶中加入12ml水和1.00ml试样。接好装置，迅速加热至沸，并继续煮沸3分钟，蒸馏即告完成。在接受瓶中，加入300ml水、10ml碱性碘化钾溶液及10ml淀粉溶液，在电磁搅拌器搅拌下，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡青色的淀粉终点。通过如下公式计算酒精含量。酒精（%，V/V）=(20.00-0.6575V)/Vs式中V硫代硫酸钠标准溶液滴定量