学 海 无 涯 1 中国药典中国药典 XXXXXXXX 年版细菌内毒素检查法年版细菌内毒素检查法 凝胶法凝胶法 凝胶法凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内 毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集 的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用 EU/ml 表示。当使用新 批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行 鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（），将细菌内毒素国家标准品或细菌内 毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀 15 分 钟，然后制成 2、0.5和 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每 稀释一步均应在旋涡混合器上混匀 30 秒钟。取分装有 0.1ml 鲎试剂溶液 的 10mm75mm 试管或复溶后的 0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿 18 支，其中 16 管分别加入 0.1ml 不同浓度的内毒素标准溶液， 每一个内毒素浓度平行 做 4 管；另外 2 管加入 0.1ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管 中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入 371恒温器中，保温 60 分 钟2 分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转 180，若管内形成凝胶，并且 凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、 变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假 阴性结果。 当最大浓度 2管均为阳性，最低浓度 0.25管均为阴性，阴性对照管 为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎 试剂灵敏度的测定值(c). c=1g -1(X/4) 学 海 无 涯 2 式中 X 为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减 的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当c 在 0.5-2(包括 0.5和 2)时，方可用于细菌内毒素检查， 并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验干扰试验 按表 1 制备溶液 A、B、C 和 D，使用的供试品溶液应为未检验 出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复 核试验项下操作。 只有当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶 液 C 和 B 的反应终点浓度的几何平均值（Es 和 Et）。 Es= 1g -1(Xs/4) Et= 1g -1(Xt/4) 式中， Xs、Xt 分别为系列溶液 C 和溶液 B 的反应终点浓度的对数值（1g）。 当 Es 在 0.52(包括 0.5和 2)及 Et 在 0.5Es2Es (包括 0.5Es 和 2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于 MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过 MVD 的进一步稀 释，再重复干扰试验。 表表 1 1 凝胶法干扰试验溶液的制备凝胶法干扰试验溶液的制备 编号 内毒素浓度/配制 内毒素的溶液 稀释用液 稀释倍数 所含内毒 素的浓度 平行管数 A 无/供试品溶液 2 B 2/供试品溶液 供试品溶液 1 2 4 8 2 1 0.5 0.25 4 4 4 4 C 2/检查用水 检查用水 1 2 4 8 2 1 0.5 0.25 4 4 4 4 学 海 无 涯 3 D 无/检查用水 2 注：A 为供试品溶液；B 为干扰试验系列；C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D 为 阴性对照。 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中 和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排 除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处 理的供试品溶液进行干扰试验。 当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒 素检查法时，须进行干扰试验。 当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有 可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。 检查法检查法 （1 1）凝胶限量试验）凝胶限量试验 按表 2 制备溶液 A、B、C 和 D。使用稀释倍数为 MVD 并且已经排除干扰 的供试品溶液来制备溶液 A 和 B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 表表 2 2 凝胶限量试验溶液的制备凝胶限量试验溶液的制备 编号 内毒素浓度/配制内毒素的溶液 平行管数 A 无/供试品溶液 2 B 2/供试品溶液 2 C 2/检查用水 2 D 无/检查用水 2 注：A 为供试品溶液；为 B 供试品阳性对照；C 为阳性对照；D 为阴性对照。 结果判断结果判断 保温 60 分钟2 分钟后观察结果。若阴性对照溶液 D 的平 行管均为阴性，供试品阳性对照溶液 B 的平行管均为阳性，阳性对照溶液 C 的平行管均为阳性，试验有效。 若溶液 A 的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定；若溶液 A 的两 个平行管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液 A 的两个平行管中的一 管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液 A 需做 4 支平行管， 若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。 学 海 无 涯 4 （2 2）凝胶半定量试验）凝胶半定量试验 本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。 按表 3 制备溶液 A、B、C 和 D。按鲎度剂灵敏度复核试验项下操作。 表表 3 3 凝胶半定量试验溶液的制备凝胶半定量试验溶液的制备 编号 内毒素浓度/配制内毒素的 溶液 稀释用液 稀释倍数 所含内毒素的浓 度 平行管数 A 无/供试品溶液 检查用水 1 2 4 8 2 2 2 2 B 2/供试品溶液 1 2 2 C 2/检查用水 检查用水 1 2 4 8 2 1 0.5 0.25 2 2 2 2 D 无/检查用水 2 注：A 为不超过 MVD 并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数 开始用检查用水稀释至 1 倍、2 倍、4 倍和 8 倍，最后的稀释不得超过 MVD。 B 为 2浓度标准内毒素的溶液 A（供试品阳性对照）。 C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。 D 为阴性对照。 结果判断结果判断 若阴性对照溶液 D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照 B 的平行管均为阳性， 系列溶液 C 的反应终点浓度的几何平均值在 0.52 之间，试验有效。 系列溶液 A 中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以，为每个系列的 反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的 内毒素浓度按公式 cE=1g -1(X/2)。如果检验时采用的是供试品的稀 释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。 学 海 无 涯 5 如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于 （如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于乘以供试品进行半定量 试验的初始稀释倍数）。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为 内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以。 若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大 于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。