大花惠兰、石斛兰的组织培养（1）材料与方法材料：大花蕙兰大花品种嫩芽。将母株放在温室内盆栽培养,于25 月陆续从母株上取8 cm 左右的新芽,剥去最外几层叶片,去芽的上半段，然后在超净工作台上采用三步灭菌处理法处理:先在70 %的酒精中处理6 s ,立即投入10 %的次氯酸钠溶液中10 min ,稍加摇动,取出后用无菌水冲洗,剥去外层23 枚叶片;再放入5 %的次氯酸钠溶液中5 min ,取出后无菌水冲洗,剥至最后1 枚叶片;再放入1 %的次氯酸钠溶液中1 min ,取出后无菌水冲洗数次。以上次氯酸钠溶液中均加入Tween20 以利杀菌剂更有效地发挥作用,在无菌条件下剥出约5 mm长地茎尖,以生长点为中心,用解剖刀把茎尖切成4 个小方块,分别接入已经准备好的培养基上。 培养基： 原球茎诱导培养基配方: MS + 0. 5 mg/ L BA +1. 0 mg/ L KT + 2 g/ L 活性炭（active carbon，AC）。 原球茎增殖培养基配方为:MS + 0. 5 mg/ L BA + 0. 8 mg/ L2 ,42D +2 g/ L AC,。 幼苗分化及生根养基配方为:MS + KT 1 mg/ L + NAA 0. 5mg/ L +2 g/ L AC。 培养条件培养基pH 5. 45. 8 ,琼脂粉0. 6 %0. 8 %,活性炭0. 2 %的,防止褐变,培养室温度2225 ,相对湿度40 %,光照12 h/ d ,光照强度为2 000 lx。（2） 结果观察 原球茎诱导：把茎尖切成的小块,接入圆球茎诱导培养基上，20天后（或更长时间）观察有无圆球茎出现。结果调查:圆球茎的诱导率= 产生圆球茎的茎尖数/ 接种茎尖数100 %。 原球茎增殖：将诱导形成的较大原球茎块切割成直径38 mm左右的小块,接种在圆球茎增殖培养基上。1 个月后统计增殖量，结果调查:原球茎增殖率= 有新原球茎的块数/ 接种块数100 %。 幼苗分化及生根：将增殖的充分成熟的较大原球茎块切割成直径38 mm的小块,接种在原球茎分化及生根培养基上。45 d 后统计分化率、生根率及根系生长状态。结果调查:幼苗分化率= 出芽数/ 圆球茎个数100 %。幼苗生根率= 生根幼苗数/ 幼苗数100 %。 壮苗、驯化与移栽：壮苗。1/2MS，7 %琼脂, pH 5.45.6，56周后植株长出粗壮的根系。光照2 000 lx；容器：23 cm 30 cm 8 cm四周镂空的塑料框；将瓶苗从培养室(恒温室)移至与外界相通的室内放置2 d后,去瓶盖炼苗3 - 7 d,洗净瓶苗根部的培养基,用1000倍甲基托布津或多菌灵浸泡组培苗根部,放置于通风阴凉处晾干水分至根系发白变软,即可用于移栽；基质。水苔和谷(麦)壳2：河沙1：珍珠岩1（体积,是大花蕙兰组培苗假植的理想基质；白天平均温度在20 以上,夜间温度在15 左右。假植相对湿度控制在80%以上。晴天上午10: 00至下午5: 00,作70%的遮荫处理，大花蕙兰刚出瓶的植株很小、十分脆弱, 放置处要求光照弱，种后用喷雾器将苗株与植材喷洒到湿润为止。每天向叶片喷水数次, 保持湿润, 切忌过干或过湿。10 天后才逐渐增加给水量。良好的浇水管理措施、可大大提高瓶苗移栽成活率。瓶苗移栽20 天以后新根长出, 可逐渐增加光照强度。每周进行1 次根外追肥，可用“花宝1 号”或“通用肥”2000 倍液喷洒。 （3）讨论 在原球茎增殖的继代培养中,2025 d 继代1 次较为合适,此时产生的原球茎未充分成熟,增殖率较高,且颜色为鲜绿色;30 d 以后新生的原球茎充分成熟,增殖率会有所降低,颜色转为深绿色;原球茎切割块的大小以直径0. 5 cm为适宜,过小易死亡降低增殖率,过大增殖率也有所降低；在培养基中加入2 g/ L AC活性碳可以有效的降低褐变率；分化及生根培养时原球茎切割的块越大分化的越早,幼苗长得越壮;同一培养基中培养的时间越长分化率越高;分化和生根可以同步进行。 （4）实例 大花蕙兰杂交新品种西维亚、玛利莲梦露、蒙米拉丝、女皇为材料，把母株放在温室内盆栽培养,于2 月底4 月初陆续从母株上取8 cm 左右的新芽,从基部切离,用自来水冲洗,再用洗洁净溶液浸泡5 min ,自来水冲洗10 min ,剥去最外几层叶片,并剪去芽的上半段. 然后在超净工作台上采用3 步灭菌处理法处理:先在70 %的酒精中处理6 s ,立即投入10 %次氯酸钠溶液中10 min ,稍加摇动,取出后用无菌水冲洗,剥去外层23 片叶; 再放入5 %的次氯酸钠溶液5min ,取出后无菌水冲洗,剥至最后一枚叶片;再放入1 %的次氯酸钠溶液1 min ,取出后无菌水冲洗数次.以上次氯酸钠溶液中均加入Tween - 60 以利杀菌剂更有效地发挥作用. 在无菌条件下剥出约5 mm 长的茎尖,以生长点为中心,用解剖刀把茎尖切成4 个小方块,分别接入已准备好的培养基上.培养条件：pH 5. 25. 6 ,蔗糖2 % ,琼脂条0. 6 %0. 85 % ,温度2225 ,光照强度2 000 lx ,每日光照12 h。培养基配方：诱导原球茎最佳激素配比为KT 0. 05 mg/L ,NAA 0. 5 mg/L，利于原球茎增殖的培养基为改良KC + KT 0. 05 mg/L + NAA 0. 5 mg/L ,以半固体培养,加香蕉泥为佳,增殖率为4. 1. 利于生根壮苗的培养基为改良KC + NAA 0. 2 mg/L ,以固体培养为佳。讨论： 灭菌处理：大花蕙兰属热带气生兰,靠根系附着在林中树木及岩石上生长,多数种类有内生菌共生. 因此外植体灭菌采用3 步处理. 据笔者经验,大花蕙兰外植体灭菌比其它植物有一定难度. 我们曾采用抗生素处理,效果不佳. 对于供试品种是否由于存在内生菌而引起外植体灭菌处理困难,以及内生菌在植物体内的分布传播情况有待进一步研究； 培养基添加香蕉泥：对大花蕙兰增殖和分化有明显的促进作用,这与香蕉泥中的有机质和天然激素有关,同时能使培养物在适宜的酸性条件下生长；原球茎切块细小、稀疏的培养瓶内,群体生长较慢,而切块较大且密集的瓶内,生长十分健壮,表现类似于群体生长效应. 因此切割时不可过细,直径要在2 mm 以上,每瓶可接种30 多个培养块,可使瓶内营养得以充分利用；接种时,采用大罐头瓶把培养块1 次夹入或铲入,稍加晃动半固体培养基即可使培养块分散开来,既节约时间、成本,又降低了污染率； 用改良KC(无机盐减半) 培养大花蕙兰,无机盐用量比其它报道用MS 培养基大大减少,增殖分化效果均佳. 采用降低琼脂用量制成半固体培养基可简化接种步骤,而且培养块浸在培养基内,降低了培养块黄枯和切口褐化的机会. 定期摇动培养瓶,能使培养瓶内营养得以充分利用. 无机盐和琼脂在培养成本中占有很高的比例,采用以上技术可大大节约成本,利于大规模生产应用；用自来水代替蒸馏水,用绵白糖代替蔗糖,用廉价的琼脂条代替琼脂粉,降低了成本,效果没有丝毫降低. 由于大花蕙兰原球茎增殖不必用小容器和相对较高的罐头瓶,可用透光性好的大容器代替； 采用1 次定植,不经移栽,可以减少对幼苗根系的损伤和节约人力. 只要保证温室内相对湿度,对成活率无显著影响,但组培苗前期生长缓慢。石斛兰的组织培养 石斛兰为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium )植物,为附生兰,与卡特兰(Cattleya) 、蝴蝶兰( Phalaenopsis) 、万代兰(Vanda)并列为观赏价值最高的“四大观赏洋兰”。石斛属是兰科中仅次于石豆兰属(B ulbophyllum )的第二大属,全世界共有1 000多个原生种,分布区域广,主要在亚洲的热带和太平洋岛屿的东亚、东南亚及澳大利亚等地区。我国石斛属植物共有74种2变种,主要分布于秦岭以南诸省区,尤以云南南部最多。石斛中的铁皮石斛、金钗石斛等是名贵药材，石解兰却是一种观赏价值很高的花卉, 其花色繁多艳丽、 花型大、 花枝长、 花多。 春石斛节生型主要作为盆栽品种, 秋石斛蝶花型主要作为切花， 也可以用来进行造型后盆栽。在繁殖上, 因为几乎所有的观赏类石解都是杂种, 不能用种子播种得到大量与亲代形状一致的植株，分株和高位芽扦插繁殖则速度很慢，一般在1年中的繁殖速度为2-3倍， 通过茎尖组织培养技术产生原球茎，在原球茎阶段进行增殖培养和分化 ，使原球茎繁育成小植株，效率很高。石斛兰增殖的另一途径就是用通过芽的增殖方式形成再生植株。 1 石斛兰组培快繁 材料与方法 材料：选取生长健壮的3-5cm石斛兰新生芽，取茎尖为材料，先用自来水冲洗干净，再用75的酒精处理8s；后用0.1升汞灭菌10min，最后用无菌水冲洗4、5次，在无菌的环境里在显微镜下剥取茎尖组织作为外植体，接种于无菌的设计的培养基上。 培养基及培养条件： 芽的诱导。MsNAA1.0mg/L6-BA4.0mg/LKT1.0mg/L，pH5.0-5.4，温度为252，漫射光（不开日光灯）。 芽的增殖和分化。MsNAA1.0mg/L6-BA4.0mg/LKT1.0mg/L，pH5.0-5.4。壮苗生根。1/2MsIBA2.0mg/L 肌醇2.0mg/L 水解酪蛋白1.0g/L+ 香蕉泥1.0g/L 。移栽基质。砖粒：木炭： 椰糠为4：1：1（体积比） 结果观察 芽的诱导。将茎尖接于芽的诱导培养基，经过40d的培养，诱导出不定芽。石斛兰为复茎性兰花，较适于用茎尖作为其快速繁殖的外植体。研究表明，带1-2个叶原基的茎圆锥成活率高，不易褐化而致死亡。 芽的增殖培养。将生长至1-1.5cm 的不定芽切下，分别转接于芽的增殖和分化培养基，30d，芽增殖倍数为12倍。 壮苗生根。选取生长健壮、高2cm以上的单个芽体接入壮苗生根培养基，60d，生根率达100，且植株根系发达粗壮，形成完整的石斛兰小植株。由于根的分化形成，加快了植株对营养的吸收，促进了茎叶的生长，达到了壮苗生根的目的。添加一定量的香蕉泥有助于石斛兰根系的分化。 试管苗的移栽。当石斛兰试管苗长5-7cm 高， 有3片以上真叶/ 时，就可进行移栽。出瓶前将瓶苗移至自然漫射光的室内炼苗7d，以增强试管苗对室外环境的适应力，提高其移栽成活率。移栽前先洗净试管苗根部培养基，用0.2甲基托布津溶液浸泡15min，然后移栽基质中。小苗移栽后应浇透水，放入温室大棚内，定根前要控制水分，只要保持叶面及基质湿润即可。石斛兰较适宜生长的温度为15-25，空气相对湿度为70-80。 讨论：春石斛用芽增殖方式获得再生植株以春石斛盆苗的茎段侧芽为材料。剪取春石斛的茎,剥离叶片后流水冲洗30 min 以上,70 %的酒精浸数秒,用无菌水冲洗1次,再用0. 1 %的升汞液浸8min ,最后用无菌水冲洗8 次,获得无菌外植体。将经过灭菌处理后的春石斛的茎在无菌培养皿内切成22. 5 cm的茎段,每一茎段上有1 个茎节。将此茎段接种在培养基中诱导侧芽生长,培养条件均为:温度(25 2) ,光照为12 h/ d，光强1600Lx，诱导培养基：MS + BA0. 5 mg/ L + NAA0. 1 mg/ L。90d后诱导出芽，转接至MS + BA0. 5 mg/ L + 2 ,4-D 0. 2 mg/ L促芽生长，90d长至约2cm，转接于增殖培养基MS + BA 3. 0 mg/ L + NAA 0. 2 mg/ L，30d，增殖约2倍；铁皮石斛根尖诱导后用芽增殖选择生长健壮、根长为3 cm 左右的铁皮石